单物镜光片显微镜的技术原理及其在生物医学的应用
以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破上述限制，展示出在高分辨率和体积高速成像方面的优势，并且可与超分辨显微术等多种技术结合，在近年来取得了巨大发展。
中国科学技术大学的张一凡团队发表综述文章《单物镜光片三维荧光成像技术研究进展（特邀）》，介绍了单物镜光片显微成像技术的原理、关键性能的提升和其在生物医学的应用。
光片显微镜概述
光学显微镜是生命科学研究的重要工具。20世纪80年代，共聚焦显微镜和双光子显微镜出现，赋予了显微镜三维解析能力，但存在光毒性和光漂白问题。
2004年，光片显微镜（LSM）出现，其激发光经柱透镜在样品上形成光片，限制了照明范围，减少了光损伤和光漂白。2008年，数字激光扫描显微镜（DLSM）是另一种形成光片的方法。
传统光片显微镜由照明光路和探测光路组成，通常需要两个正交的物镜。但双物镜的使用带来了一系列问题，如样品装载手段复杂、不能使用常用载玻片、限制样品种类和安装，需要物镜有较长工作距离，限制了高分辨率图像的获得，两个光路间还需要精确对焦。
而以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破了上述限制，并展示出了在高分辨率和体积高速成像方面的优势。
单物镜光片显微镜技术原理
倾斜平面照明显微镜（OPM）
2008年，Dunsby发明了倾斜光片照明显微镜。它把柱透镜生成的片状照明光引入原先探测物镜的光路，同时在成像光路中设计了远程聚焦系统，引入二级和三级物镜来复制和成像样本的三维信息。
三维成像扫描方式
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移动载物台扫描：这是一种常见的方法，通过移动载物台使光片扫过样品各部分。但它有很多缺点，比如受样品体积限制，运动不稳定会耗时，还会引入运动伪影影响图像质量。后来Kumar等进行了改进，把物镜压电移动平台安装在二级物镜处，通过移动二级物镜来改变光片位置实现三维扫描，提高了成像速度。
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利用检流计振镜扫描：这种方法可以使照明光片快速扫过样本。例如Bouchard等开发的平面扫面共焦（SCAPE）显微镜，利用定制六边形振镜大大提高了三维成像速度。之后还有很多改进的扫描方式，像SOPI-OPM、SCAPE 2.0等，它们在提高速度的同时也不断优化成像效果。
多视图光片成像
在实际成像过程中，光片穿过样品会因为散射、吸收等问题导致光衰减，尤其是在脑组织等复杂生物样品中，散射会让图像质量下降很快。多视图光片显微镜就可以解决这个问题，它利用两个或多个不同方向的光片照明，获得多个视角的图像，再通过图像融合算法把这些图像组合起来，减少散射引起的伪影，得到各向同性分辨率的图像。
基于微镜反射的单物镜光片显微镜
针尖微悬臂反射镜
2013年，Gebhardt等开发了利用原子力显微镜（AFM）臂的反射型光片显微镜，斜入射的光片在壁上反射照明样品。2018 年，Ponjavic等利用原子力显微镜的单臂也开发了一种单物镜光片显微镜。
微流控制备微反射镜器件
2015年，Galland等设计了一款特别的单物镜光片显微镜。它不需要远程聚焦系统，光片方向垂直于物镜光轴。它使用定制的样品装载容器，把45°反射微镜放在硅片的微孔里。照明光束从物镜后焦面斜入射，经反射后形成垂直光轴的照明光片。这个显微镜还可以和倒置商用标准显微镜兼容，能使用多种物镜，生成不同厚度的光片，满足多种尺度的研究需求。
单物镜光片显微镜关键性能提升
空间分辨率
OPM虽然解决了正交光片显微镜不能使用高数值孔径物镜的问题，但实际使用中，物镜的高数值孔径并不能完全被利用。这是因为照明光束会分占一部分数值孔径，而且远程聚焦系统中第二物镜与第三物镜倾斜放置，导致光不能完全中继到第三物镜上。
成像视场
三级物镜远程聚焦系统对显微镜的视场范围有影响。光片显微镜的轴向分辨率和视场是相互制约的。在倾斜光片显微镜中，远程聚焦系统是视场限制的主要原因。
为了增大视场，研究人员想出了很多方法，比如扩展平面成像、利用反射闪耀光栅、利用Scheimpflug条件等，还有一些新颖的方案是取消远程聚焦系统。
单物镜光片显微镜在生物医学的应用
倾斜平面照明显微镜的生物医学应用
光片显微镜因为光毒性低，常被用于活体胚胎等大样本的长时间发育成像。单物镜光片显微镜更是把振镜扫描方式引入光片显微镜的三维成像，极大地提高了体积成像速度。
它还可以用于高通量成像，像结合声流控聚焦设计多色3D成像流式细胞术，同时对多个细胞进行检测。在医学检验方面，也有应用，比如开发了Medi-SCAPE用于活体肿瘤监测，还应用于眼科成像，对眼底视网膜进行三维成像，检测血流动力学等。
基于微镜反射的单物镜光片显微镜的生物医学应用
这类显微镜可以使用高NA物镜对多孔板进行成像，移动位移台时不需要重新聚焦样品。
单物镜光片显微镜的超分辨成像拓展
单分子定位超分辨成像
典型的单分子方法如STORM，单分子超分辨方法中荧光信号微弱，图像信噪比越高，单分子定位精度越高。光片显微镜具有低背景荧光的优势，与单分子定位技术结合后，可将厚样本纳入研究范围，在多种单物镜光片架构中都有应用。
结构光照明超分辨成像
SIM超分辨显微术具有相对较快的速度，与光片技术常用于活细胞的成像场景。单物镜的架构为结构光带来了新机遇，如2022年Chen等的设计用一个带有振镜与静态镜组合的图像旋转器的单物镜光片显微镜，可获得各向同性的超分辨图像。
结论与展望
光片显微镜因光学切片及与多种光学技术的适用性而迅速发展。单物镜光片显微术有诸多优点，解决了传统光片显微镜的载玻片使用、几何空间限制及正交光片显微镜不能用高NA物镜的问题，联合超分辨成像技术后分辨水平进一步提升，推动了其在生物学实验室的应用，适用于高速生命活动观察和在体成像场景，是快速体积成像利器。
