单细胞脑类器官筛选用于鉴定自闭症的发育缺陷

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文章标题：Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism
中文标题：单细胞脑类器官筛选用于鉴定自闭症的发育缺陷
期刊：Nature
IF：50.5
研究机构：奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）
doi: 10.1038/s41586-023-06473-y

01 简介

人类大脑的发育涉及许多独特且复杂的过程，这些过程在其他许多物种中都未曾见到。这些过程可能导致神经发育障碍（Neurodevelopmental disorder, NDD），如自闭症谱系障碍（ASD）。ASD的检测只能在发育成熟的大脑中实现。脑类器官作为一种类大脑的三维细胞培养系统，提供了在体外研究人类大脑发育的可能性。虽然脑类器官可以用来在人体环境中研究神经发育障碍，但也受到变异性和低通量的限制。本文介绍了一种结合了类器官、基因编辑及单细胞转录组技术的新系统，用于研究ASD相关基因对细胞命运决定和发育阶段的影响。

研究者开发了CRISPR-human organoids-scRNA-seq（CHOOSE）系统，这个系统结合了CRISPR/Cas9基因编辑技术和单细胞转录组技术，用于高效筛选和分析与ASD相关的基因。使用已验证的gRNA对和可诱导的CRISPR/Cas9系统在类器官中进行基因敲除筛选，可以使类器官中的每个细胞最多携带一个特定ASD基因的突变。利用单细胞多组学数据，包括转录组和染色质可及性构建类器官的发育基因调控网络，在单细胞水平上追踪每个突变的影响。随后，研究了36个与ASD相关的高风险基因对细胞类型和发育轨迹的影响。

02 技术路线

1、类器官生成
使用人类胚胎干细胞（hESCs）生成类器官，确保类器官中存在丰富的端脑组织。

2、gRNA设计和验证
针对每个目标基因设计一对引导RNA（gRNA），选择与自闭症谱系障碍（ASD）相关的高风险基因。这些基因与转录调控和发育过程相关，具有研究价值。

3、构建CRISPR载体
使用诱导型CRISPR/Cas9系统，将gRNA和Cas9基因构建到同一个载体中。这种系统可以通过加入诱导剂（如四环素）激活Cas9的表达，从而控制基因敲除的时间和空间。将CRISPR载体转染入hESCs，通过抗性筛选和流式细胞术确定成功转染的细胞克隆。

4、克隆条形码标记
为每个dual-sgRNA cassette引入克隆条形码，以标记各个细胞的遗传操作。这些条形码在单细胞测序中用于追踪每个细胞的遗传背景。通过PCR和测序验证条形码的独特性，确保每个细胞克隆都可以被准确识别来验证条形码的独特性和稳定性。

5、单细胞RNA测序（scRNA-seq）
将类器官解离成单细胞悬液，使用10x Genomics Chromium系统进行单细胞捕获和cDNA合成。构建单细胞RNA测序文库，使用Illumina测序平台进行高通量测序，获取每个细胞的基因表达数据。

6、数据分析
对单细胞RNA测序数据进行预处理，包括过滤低质量细胞和去除背景噪音。使用聚类分析和标记基因表达水平，鉴定类器官中的不同细胞类型。应用伪时间分析（pseudotime analysis）构建细胞发育轨迹，研究不同基因敲除对细胞分化路径的影响。结合转录组和染色质组数据，构建类器官的发育基因调控网络，识别ASD相关基因的调控模块。

7、实验验证
在特异性诱导多能干细胞（iPSCs）生成的患病类器官中，验证关键基因（如ARID1B）对细胞命运决定的影响，与未进行基因编辑的类器官进行对照，分析基因敲除的具体效应。

03 实验结果

Figure 1

展示了用于人脑类器官中ASD风险基因筛选的CHOOSE系统。使用了带有条形码的双sgRNA，在多个时间点评估了gRNA的编辑效率和分布。通过UMAP展示了scRNA-seq数据集中的背侧和腹侧大脑区域轨迹。热图展示了不同细胞类型中标志基因的表达，RNA速率分析显示了发育方向 。
 

Figure 2

显示了24个基因干扰下细胞类型丰度的显著变化。发现大多数基因干扰导致背侧-腹侧细胞比例的降低。具体基因如KMT2C的干扰导致背侧细胞的减少和腹侧细胞的增加。某些基因干扰只影响特定细胞类型，例如ADNP、MED13L、ILF2和DDX3X 。

Figure 3

比较了不同基因干扰条件下的基因表达变化。图中展示了DEGs（差异表达基因）在不同TF模块中的富集情况，如MEF2C、BCL11A、SATB2和OLIG1。这些富集的TF模块与ASD的相关基因有显著的关联 。

Figure 4

描述了一位ARID1B突变患者的脑发育情况。使用SNP分型显示在6号染色体上的一个微缺失。患者在两个妊娠阶段的GE（LGE和CGE）体积与年龄匹配的对照组的比较。数据表明，ARID1B突变可能导致GE体积的异常增大 。这些图展示了ASD相关基因在脑类器官中的影响，揭示了基因干扰如何导致特定细胞类型的变化以及这些变化与ASD症状的潜在关联。

04 总结

这项研究开发了一种高效的CHOOSE系统，实现了在类器官中进行大规模基因功能研究的可能性。研究结果表明，ASD高风险基因对大脑类器官的发育有显著影响，特别是在细胞命运决定和发育阶段的调控上。干扰BAF复合物的成员（如ARID1B）会导致腹侧端脑祖细胞数量增加，且ARID1B控制祖细胞向少突胶质前体细胞和中间神经元的转变。这一发现通过患者特异性iPSC衍生的类器官得到了验证。这项研究为在人类类器官模型中表征疾病易感基因的表型奠定了基础。

本文创新性地结合了CRISPR基因编辑和单细胞转录组学技术，建立了一个强大的筛选系统，揭示了ASD相关基因在大脑发育中的重要作用。研究结果不仅拓展了我们对自闭症发病机制的理解，还为未来利用类器官模型进行疾病研究和药物筛选提供了新方法。