细胞周期的数据质量评估和常见应用场景
流笔记
周期数据质量评估工欲善其事，必先利其器。漂亮的细胞周期数据离不开性能优异的仪器，因此，首先需要通过《中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017》[1]来评估流式细胞仪的性能。本文中使用BD的DNA质量控制试剂盒，对层浪流式细胞仪检测到的DNA数据进行质量评估。
DN质量控制试剂盒内容：🔶 小鸡红细胞核（CEN）：用于建立测试条件。
CEN试剂经过特殊处理，内含单个核、双联体核、三联体核和更大的聚集体，用来检测仪器的线性度和分辨率。经PI染色后，由于细胞核聚集程度的不同，在PI的直方图中会出现至少4个峰，前4个峰分别代表单个核、双联体核、三联体核和四联体核。若染色正常，仪器线性度良好，则四个峰所在道数的平均比值接近1:2:3:4。
🔶 小牛胸腺细胞核（CTN）：具有一个完整的细胞周期，且具有细胞周期的各个时期，大部分核处于G0/G1期，小部分处于S期和G2/M期。还可作为细胞周期统计分析的质控。
🔶 2μm的荧光微球：作为一种稳定的非生物标准品来确认仪器的CV（细胞离散度），要求仪器CV＜2.3%。
🔶核酸染料碘化丙啶（PI）
图1：DNA QC试剂盒数据
数据评估结果：01
1. 出现明显7峰，且检测CEN结果为（图1A）PK1:PK2:PK3:PK4:PK5:PK6:PK7 = 1.00:2.00:2.99:3.97:4.94:5.93:6.87 (≈1:2:3:4:5:6:7)。
【行业要求CEN结果满足至少出现4个峰，且前四个峰的比值接近1:2:3:4】02
2. CTN检测结果为周期拟合G2/G1=2.01（图1B）。
【行业要求G2/M与G0/G1的平均荧光强度比值在1.95-2.05之间】03
3. 2μm微球结果CV=1.75%（图1C）。
【行业要求CV＜2.3%】
综上可得，层浪流式细胞仪在DNA检测中表现良好，QC数据均远超行业标准，满足临床/科研实验需求，是流式分析细胞周期的卓越选择。
细胞系是周期实验研究常用的样本，如图2分别依次为A图：MCF-7乳腺癌细胞系、B图：MDA-MB-231乳腺癌细胞系、C图：HL-7702[L-02;LO2]肝细胞系。不同细胞系周期检测及拟合结果如下图所示：
图2：常见细胞系自动周期拟合
数据分析与解读
1. 三种细胞系检测到的CVG1值分别为：
MCF7-1.63%、231-2.09%、LO2-2.93%。
【正常二倍体的CVG1应＜8%】
注：G0/G1峰的CV（CVG1）显著影响S期计算的准确性，然而在实际应用中，由于肿瘤样本会存在多个亚群，其CVG1值可能会偏高，影响结果。建议将CVG1＜8%的肿瘤样本用于有用的S期测定。
2. 检测到的RCS（限制性立方样条回归，用来反映样本的拟合程度）分别为：3.55、2.78、3.70。
【RCS＜3.0，表示拟合良好；RCS在3.0-5.0，被认为是基本拟合；RCS＞5.0，表明拟合匹配度差】
2、生殖细胞
在生殖相关研究中，生殖细胞不同时期百分比的变化一直是研究的重点。以C57BL/6小鼠精囊为例，可以检测到不同时期的细胞数量百分比：亚倍体（sub1N）细长精子细胞；单倍体（1N）圆形精子细胞；二倍体（2N）精原细胞；四倍体（4N）精原细胞G2M期。使用层浪流式细胞仪PI检测精细胞周期结果如图3所示：
图3：C57BL/6小鼠精囊周期检测
数据分析与解读亚倍体（sub1N）和单倍体（1N）百分比为64.66%、二倍体（2N）百分比为7.52%、四倍体（4N）的百分比为20.84%，与文献报道中正常C57BL/6生殖细胞占比一致。[2]
3、植物细胞植物细胞的多倍化对于研究个体生长发育具有重要的生物学意义。流式细胞仪检测植物倍体具有简单、快速、准确、直观等优点，在植物学中有着越来越广泛的应用价值。模式生物拟南芥是植物倍体研究的经典角色，用层浪流式细胞仪对其叶片倍体进行检测和分析，得到图4结果：
图4：拟南芥叶片周期检测
数据分析与解读1.PK1:PK2=1:1.9，接近1:2。
注：植物周期检测一般不用周期拟合软件拟合，根据标准品确定样本有单倍体、二倍体、四倍体，或者多倍体。植物可以检测的样本有：根、茎、叶、种子、花等。
总结
一键拟合功能示意
层浪流式细胞仪对DNA QC试剂盒（CEN/CTN/微球）的各项检测结果均表现优异，表明仪器的性能不仅满足各类样本细胞周期检测的需求，其检测结果更是远优于行业检测标准的要求，特别是CEN检测，可以检测出多个峰值，且符合倍比关系。
除此之外，层浪流式细胞仪分析软件ModelFlower内置细胞周期分析功能，可以对周期数据进行一键拟合，并有批量分析与批量数据导出的功能。
注意事项
· 除去碎片之外，建议可供分析的目的细胞在1万以上，虽然细胞数据过大会影响到分析的速度，但不会对细胞各个时期的百分比检测产生影响，拟合效果反而更好，因此在条件允许的情况下，收集量多多益善。拟合不准确可以自行调整吗？
· 自动拟合之后如不满意结果，也可以通过手动调整的方式，改变G1和G2门的位置，还可以批量应用到其他样本中以保持一致性。
· 首先，不同细胞系的拟合效果存在差异。其次，影响周期拟合效果的因素还有：试剂盒差异、细胞固定方式的影响、收集细胞量的差异、人为操作影响等。因此，为了尽量减少差异，操作标准要规范，最大程度上避免操作误差。|流笔
参考文献
[1]中华人民共和国医药行业标准YY/T 0588-2017,流式细胞仪.国家食品药品监督管理局.2017.
[2]R.B. Struijk,1 C.M. De Winter-Korver,1 S, Simultaneous Purifification of Round and Elongated Spermatids from Testis Tissue Using a FACS-Based DNA Ploidy Assay，International Society for Advancement of Cytometry.
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