人类嗜T淋巴细胞病毒 (HTLV)1型和2型RT- PCR试剂盒说明书
人类嗜 T 淋巴细胞病毒（Human T-cell Lymphoma Virus ，HTLV）属反转录病毒，含有 RNA 和反转录酶，是致瘤性 RNA 病毒，可分为 HTLV1 型和 HTLV2 型。本试剂盒可 在一次反应中快速检测两种病毒：HTLV1 和 HTLV2 。根据探针法荧光定量 RT-PCR 原理 开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供核酸（含 DNA 和RNA）模板。
2. 提供两种病毒的阳性对照，便于区分假阴性样品。
3. 反应快速，灵敏度高。
4. 对所有单个病原体的高灵敏度和强特异性。
5. 可用于高通量检测。
6. 本试剂盒足够做 25μL 体系的探针法荧光定量 PCR 50 次，只能用于科研。
成分规格
保存条件 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试 剂。
用自选方法提取纯化样品核酸，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒（离心柱型）提取核酸。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样 品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL DEPC-H2O ，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟， 得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
若有 N 个待检样品，准备 N+2 个 qPCR 管(N 个待检样品+1个阴性对照+6 个阳性对 照) ，向各 PCR 管中分别加入下列成分。
转移至样本准备区。
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 2μl 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、 HTLV1& HTLV2 双重 RT-qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
荧光基团和猝灭基团选择如下表：
六、结果分析
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制 标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA/RNA 浓度的 log 值，推 算出其浓度。
2. 如果无需制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照结果：Ct 值<30 ，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。 阴性对照结果：Ct 值>38 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<35 ，有明显指数增长，表明样本中检测出该病毒，结果为阳 性；Ct 值>38 或无 Ct 值，表明样本中未检测出该病毒，结果为阴性；Ct 值在 35-38 范 围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 35~38 范围，有明显指数增长，则 判定为阳性，否则为阴性。
1. 即开即用，用户只需要提供核酸（含 DNA 和RNA）模板。
2. 提供两种病毒的阳性对照，便于区分假阴性样品。
3. 反应快速，灵敏度高。
4. 对所有单个病原体的高灵敏度和强特异性。
5. 可用于高通量检测。
6. 本试剂盒足够做 25μL 体系的探针法荧光定量 PCR 50 次，只能用于科研。
成分规格
| 产品组成 | 编号 | 规格 |
| 2 × OneStep Probe Mix | GZ021101a | 650 μl |
| OneStep Probe Enzyme Mix | GZ021102b | 55 μl |
| DEPC-H2O | GZ070403 | 1 ml |
| HTLV1& HTLV2 双重 RT-qPCR 引物-探针混合液 | GZ02587812yp |
160μl |
| HTLV1& HTLV2 双重 RT-qPCR 阳性对 照(1×10E8 拷贝/μL) |
GZ02587812pc |
60 μl |
用自选方法提取纯化样品核酸，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒（离心柱型）提取核酸。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样 品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL DEPC-H2O ，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟， 得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
若有 N 个待检样品，准备 N+2 个 qPCR 管(N 个待检样品+1个阴性对照+6 个阳性对 照) ，向各 PCR 管中分别加入下列成分。
| 成分 | N 个 待检样品管 |
qPCR 阴性对照 | qPCR 阳性对照 |
| 2 × OneStep Probe Mix | 各 12.5 μL | 12.5 μL | 12.5 μL |
| OneStep Probe Enzyme Mix | 各 1 μL | 1 μL | 1 μL |
| HTLV1& HTLV2 双重 RT-qPCR 引物-探针混合液 | 各 3 μL | 3 μL |
3 μL |
| DEPC-H2O | 各 6.5 μL | 6.5 μL | 6.5 μL |
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 2μl 模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、 HTLV1& HTLV2 双重 RT-qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 反转录 | 50℃ | 15 min |
| 预变性 | 95℃ | 3 min |
| qPCR 反应 （40 个循环） | 95℃ | 15 sec |
| 60℃ | 20 sec | |
信号通道 |
同时选择 FAM/Cy5 通道采集荧 光信号 | |
荧光基团和猝灭基团选择如下表：
| Target | 荧光基团 | 猝灭基团 |
| HTLV1 | FAM | None |
| HTLV2 | Cy5 | None |
六、结果分析
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制 标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA/RNA 浓度的 log 值，推 算出其浓度。
2. 如果无需制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照结果：Ct 值<30 ，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。 阴性对照结果：Ct 值>38 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<35 ，有明显指数增长，表明样本中检测出该病毒，结果为阳 性；Ct 值>38 或无 Ct 值，表明样本中未检测出该病毒，结果为阴性；Ct 值在 35-38 范 围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 35~38 范围，有明显指数增长，则 判定为阳性，否则为阴性。
