空间转录组学在揭示独特和保守的肿瘤核心和边缘结构中的应用
期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
主要技术： ScRNA-seq、ST
导语
肿瘤微环境的空间组织对生物学和治疗反应有着深远的影响。对hpv阴性口腔鳞状细胞癌(OSCC)进行了单细胞和空间转录组学分析，以全面表征肿瘤核心(TC)和前沿(LE)转录结构中的恶性细胞。发现TC和LE具有独特的转录谱，邻近的细胞组成和配体-受体相互作用的特征。证明了与LE相关的基因表达谱在不同的癌症中是保守的，而TC是组织特异性的，突出了肿瘤进展和侵袭的共同机制。此外，发现LE基因标记与较差的临床结果相关，而TC基因标记与多种癌症类型的预后改善相关。最后，使用计算机建模方法，描述了OSCC中可预测的与药物反应相关的细胞发育的空间调节模式。作者的工作提供了对TC和LE生物学和交互式空间地图集的泛癌症见解(http://www.pboselab.ca/spatial_ OSCC/;http://www.pboselab.ca/dynamo_OSCC/)，这可以为开发新的靶向治疗奠定基础。
主要技术
ScRNA-seq、ST
研究结果
1. OSCC样本的ST谱分析和细胞反褶积
使用10x Genomics Visium平台对来自10例独特患者的12个新鲜冷冻的手术切除的OSCC样本进行了ST检测。从24876个点的转录组被测序到每个点43648个标准化后的平均reads。对每个肿瘤样本的苏木精和伊红（H&E）染色图像进行了检查，并对形态学区域进行了注释。通过对单独的、公开的HNSCC scRNA-seq数据集的ST数据进行整合分析，确定了病理注释的鳞状细胞癌区域中存在的恶性肿瘤细胞和其他细胞亚群的组成。为了识别恶性肿瘤斑点，严格地描述恶性细胞为反褶积评分>0.99，或CNV概率评分>0.99。CNV分析显示3号染色体反复缺失，9号染色体出现扩增。经过对分类的细胞进行批效应校正和降维后，ST反映了转录谱的连续体。空间反褶积分析显示，几乎所有样本中都存在癌细胞、ecm-myCAF、中间成纤维细胞、detox-iCAFs、树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞和细胞毒性CD8+ T细胞类型。
Fig 1. OSCC患者样本的ST分析和细胞反褶积实验设计概述
2. 无监督聚类结果显示，TC和LE是肿瘤微环境的功能异质性成分
在识别和注释了主要由癌细胞组成的恶性肿瘤spot后，进行了无监督的louvain聚类，以揭示癌细胞表达谱的空间异质性。生成了14个louvain簇，这些簇可被划分为3个主要cluster。通过差异基因表达分析对主要的聚类进行了表征。将cluster1标注为“肿瘤核心”（TC），将cluster3标注为“前沿”（LE）。cluster2由于其TC和LE DEG程序的组成而被注释为“短暂性”。
从两个空间区域内的整个转录组基因表达谱中生成了一个相关矩阵。在不同患者的TC内和LE内，通常观察到高度的相关性。LE点显示出与细胞周期、上皮-间充质转化（EMT）和血管生成相关的基因的高表达。LE中的EMT评分也在很大的范围内表达，与EMT连续体模型一致。IPA预测了GP6、EIF2和HOTAIR调控典型信号通路在患者LE中的激活。这些特征可能反映了OSCC LE在控制侵袭性和转移性行为中的作用。这些发现提示OSCC可能调节肿瘤微环境中的免疫反应，并具有促进或抑制肿瘤进展的作用。
Fig 2. TC和LE是OSCC微环境中空间独特的区域
3.TC和LE中的不同的癌细胞状态
在几个患者的同一肿瘤微环境中可能存在多个分子亚型，但亚型组成的模式并不一致。总体来说，基础亚型的TC状态最丰富，而非典型亚型的TC状态最丰富。典型的OSCC标记物在LE和TC之间的表达没有显著差异。此外，在整个UMAP投影中，CSC标记物的表达均匀，表明CSC群体在整个OSCC肿瘤中均可见。TC和LE的独特生物学谱可以通过独特的癌细胞状态的存在来解释——保守的基因表达程序从特定的肿瘤微环境相互作用中动态表现出来——包括CSC和非干细胞样恶性细胞。先前探索动态CSC状态的文献提出，LE中存在间充质样CSCs，TC中存在上皮样CSCs。当将与这些不同的CSC状态相关的基因集评分到ST数据集时，结果证实了LE中间充质样CSC状态存在高充质样CSC表达，TC中存在上皮样CSC状态。通过对连续组织切片的免疫荧光染色，进一步验证了这些CSC状态的定位，发现CD24标记在TC，CD44标记在LE。这些发现加强了TC和LE生态位内的可塑性，从而促进转录独特的癌细胞状态的繁殖。
4. TC和LE结构显示出不同的配体-受体相互作用
使用CellChat软件包进行了细胞间的通信分析。ANGPTL、GRN、NECTIN和EPHB信号通路只存在于TC中，CSPG4只存在于LE中。一些ECM重构途径，包括胶原蛋白、肌腱蛋白和层粘连蛋白，在TC和LE中也有表达。相对于TC-TC信号通路，LE-LE信号通路中上调的输出信号模式加强了这些通路在促进肿瘤侵袭和转移中的作用。
TC-TC癌细胞信号通路可以通过粘附配体-受体对DSC2-DSG1和ANGPTL4- SDC1等方式发生。LE-LE癌细胞可以通过粘附配体-受体对LAMB3- ITGA6_ITGB4和LAMB3-ITGA6_ITGB1，以及炎症配体受体对MIF-CD74_CD44发出信号。MIF-CD74配体-受体对先前已经被确定可以启动致癌信号通路。
相对于TC点，富集细胞毒性CD8（+）T细胞、ecm-myCAF、中间成纤维细胞和巨噬细的邻近点数量显著增加。TC和LE中的恶性细胞参与了不同的细胞-细胞通信模式，进一步塑造了它们独特的生物学特性。
Fig 3. TC和LE癌细胞状态具有不同的实体，具有独特的配体和受体相互作用
5. TC和LE基因特征在癌症中是保守的，它们对预后的影响是不同的
在TC点、LE点和所有其他剩余的点上训练了三个基于机器学习（ML）概率的预测模型，以生成一个空间-区域预测模型。将预测ML模型应用于横跨17种不同癌症类型的30个公开可用的ST样本，以描述每个样本中的每个点为“TC”、“LE”、“短暂性”或“其他剩余点”。模型10倍交叉验证显示，在所有模型中LE区域的ROC最低，因为其灵敏度相对较低，为0.694。在黑色素瘤（SKCM）、结直肠腺癌（COAD）、皮肤鳞状细胞癌（cSCC）和宫颈鳞状细胞癌（CESC）样本的空间分离癌细胞状态中表现良好。在所有30个样本中都发现了高度空间分离的LE点。模型在识别cSCC、黑色素瘤、CESC和COAD组织切片中的TC斑点方面表现特别好，这可能归因于这些癌症中存在角化程序。这些开创性的结果表明，LE相关的表达状态在多种癌症环境中是保守的，而与TC相关的表达谱更具有组织特异性。
为了检验LE和TC的预后意义，纳入了来自包含匹配生存数据的大规模转录组数据集（TCGA）的样本。共选择275例hpv阴性OSCC患者进行生存分析，根据TC和LE中差异表达基因的表达对每个样本进行富集评分。生成Kaplan-Meier曲线，以可视化总生存（OS）、疾病特异性生存（DSS）和无进展间期（PFI）与TC和LE信号高或低表达之间的差异。
由于LE状态似乎适用于不同的癌症类型，进一步确定了LE特征对预后的影响，并将分析扩展到TCGA中的20种常见实体肿瘤。在多种癌症中，除了OS和肺鳞状细胞癌（LUSC）外，高LE评分与较差的OS和DSS始终相关。除了黑色素瘤（SKCM）和LUSC外，LE和PFI之间也存在类似的关联模式。较低的TC特征评分与较高的淋巴结分期、淋巴血管侵犯、较高的肿瘤分级、阳性边缘和囊外扩散；而较高的LE特征评分与任何临床特征无关。
Fig 4. 机器学习模型识别了多种癌症类型的保守TC和LE特征
6. 通过分析TC和LE之间的RNA剪接动力学，揭示了分化轨迹
利用scVelo，它通过解释基因特异性转录动力学，建立在RNA速度的基础上，来表征TC和LE中存在的癌细胞的发育轨迹。在空间去卷积的癌细胞中免疫球蛋白（Ig）基因已在几种上皮性癌症中检测到。虽然确切的机制尚不清楚，但肿瘤来源的Igs与肿瘤的增殖、侵袭和转移、免疫逃逸和EMT样表型的介导有关。这些发现预测，TC经历了分化增加，保留了上皮样表型，而LE变得越来越间充质。TC和LE中其他差异剪接的驱动基因包括原癌基因和肿瘤抑制基因。
7. 获得OSCC的治疗靶点
应用了一种计算机微扰方法来识别可能预测OSCC治疗成功的RNA速度的保守模式。分析了至少25个HPV阴性HNSCC细胞系中417种药物的PharmacoDB药物反应数据，发现140种药物-基因相互作用被确定为从DGIdb70上调或下调。在高AAC药物相对于低AAC药物的净流出LE转移概率的定量测量显着增加。在几种无效药物(低AAC)中发现了相反的表型，显示出与基线状态相似的过渡层次。
Fig 6. RNA剪接动力学分析揭示了TC和LE的不同发育轨迹和治疗脆弱性
参考文献：
Arora R, Cao C, Kumar M, Sinha S, Chanda A, McNeil R, Samuel D, Arora RK, Matthews TW, Chandarana S, Hart R, Dort JC, Biernaskie J, Neri P, Hyrcza MD, Bose P. Spatial transcriptomics reveals distinct and conserved tumor core and edge architectures that predict survival and targeted therapy response. Nat Commun. 2023 Aug 18;14(1):5029. doi: 10.1038/s41467-023-40271-4IF: 16.6 Q1 . PMID: 37596273; PMCID: PMC10439131.
