全自动DNA片段回收仪揭示脆性X综合征长突触基因的空间协调异染色质化

【Cell】Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome

脆性X综合征中长突触基因的空间协调异染色质化

脆性X综合征（FXS）是由FMR1基因5’UTR区中CGG短串联重复序列（STR）的扩增引起的。在这类重复扩增疾病中，短串联重复序列（STR）的不稳定性会导致转录沉默。对于FXS，CGG重复次数达突变长度（mutation-length，ML）后，会通过局部DNA甲基化抑制FMR1基因表达。作者在FXS患者衍生的iPSC、iPSC衍生的神经祖细胞、EBV转化的淋巴母细胞和具有突变长度CGG扩增的脑组织中，常染色体上发现了Mb级H3K9me3结构域，并且X染色体上的FMR1基因也有同种结构。H3K9me3结构域通过染色体间相互作用连接，并分为染色体拓扑结构域（topologically associated domain，简称TAD） 严重错误折叠和成环，它们存在于S末期复制的长突触基因中，复制应激诱导的断裂双链中，以及易发生逐步体细胞不稳定性的STR中。将突变长度（mutation-length，ML）CGG转换成突变前长度（premutation length， PL）的CRISPR工程，可逆转X染色体和多个常染色体上的H3K9me3重折叠TADs区域，并恢复基因表达。H3K9me3结构域也可以出现在正常长度的iPSC中，这表明它们之间联系不局限于FXS。研究结果揭示了易受不稳定性影响的基因座之间的Mb级异染色质化和反式相互作用。

该研究利用 Nanopore 纳米孔测序、Mb级 Hi-C、CRISPR 和单细胞 Oligopaint FISH 成像等技术，发现脆性 X 染色体综合征（FXS）患者的常染色体上也存在 CGG 域的 DNA 甲基化，提出空间协调转录沉默模型，为 FXS 疾病的分子机制探究开辟新方向。与正常情况对比，具有ML CGG扩增的FXS患者衍生的细胞系和脑组织更容易在常染色体和X染色体上产生Mb级H3K9me3结构域。H3K9me3结构域在S期结束时复制，以反式相互作用，并产生TADs、亚TAD以及环等不同类型严重Mb级错误折叠。它们与长突触基因，复制应激诱导的双链断裂，以及易受逐步体细胞不稳定性影响的STR紧密相关。通过将ML CGG转化为PM CGG，可以逆转X染色体和多个常染色体上H3K9me3信号；此时TAD被重折叠，反式相互作用不受限制，基因表达恢复。研究结果揭示了BREACHes（beacons of repeat expansion anchoredby contacting heterochromatin，通过接触异染色质锚定的重复扩增信标）——连接Mb级H3K9me3结构域、顺式中严重的染色质错误折叠、长程染色体间相互作用和重复基因组的不稳定性。

文中通过CRISPR-Cas9靶向剪切FMR1基因座5’UTR区中CGG短串联重复序列后，使用Blue Pippin全自动DNA电泳回收仪，选用“0.75DF 3-10 kb Marker S1”试剂盒，精准回收5-12 kb Cas9-cut DNA，构建靶向长读长文库，并在MinION测序仪上进行了长读长测序。

原文
Malachowski, Thomas, et al. "Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome." Cell 186.26 (2023): 5840-5858.

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