InnoScan基于ANPMP标签天然聚糖综合分析新方法详解

   
    摘要：聚糖通过碳水化合物-蛋白质相互作用介导各种生物过程，聚糖微阵列已成为理解这些机制不可或缺的工具。 然而，由于缺乏从糖复合物中获得具有不同结构的天然聚糖文库方便且通用的方法，功能糖组学的进展受到阻碍。 为了应对这一挑战，中国一研究团队开发了一种方法，可以对N/O-聚糖进行一锅法释放并同时捕获、分离、结构表征和的功能分析。使用该方法，将糖缀合物与吡唑啉酮型异双功能标签-ANPMP 一起孵育以获得聚糖-2ANPMP 缀合物，然后将其转化为聚糖-AEPMP 缀合物。 该团队从猪胃粘蛋白、大豆蛋白、人乳低聚糖等制备了一个标记聚糖文库，通过 N-乙酰化和全甲基化衍生化后，通过 ESI-MSⁿ 分析对聚糖进行详细的结构表征，结果揭示了超83个含有各种天然聚糖表位的高纯度聚糖-AEPMP。构建鸟枪式微阵列来研究蛋白质和抗血清对聚糖的结合情况。
 
    碳水化合物是自然界中最丰富的生物大分子，在许多生物和病理过程中发挥着重要作用。人们对聚糖及其在生物医学中的作用日益浓厚的兴趣，引领了功能糖组学领域的发展。聚糖微阵列已被证明是一种成功的高通量筛选工具，可用于确定蛋白质-聚糖相互作用。扩展聚糖库以包含更多样化的结构对于推进功能糖组学至关重要。 尽管存在用于合成结构确定聚糖的化学或化学酶方法，但它们耗时、昂贵，并且需要大量劳动。 这限制了生物医学相关聚糖的获取，并阻碍了其确切生物学作用的确认。另一种途径涉及从天然来源中释放、标记和分离聚糖。 连接到糖蛋白的N/O-聚糖或连接到鞘糖脂的聚糖可以使用化学和酶促方法释放。然而，N-聚糖释放酶价格昂贵，并且仅适用于选定的底物。 相比之下，化学方法，例如肼解和碱解，会引起严重的脱乙酰和剥离副反应，并且需用有毒化学品。 由于缺乏裂解 O-聚糖的广谱 O-糖苷酶，它们的释放依赖于化学过程，例如通过Carlson 降解进行 β-消除或不进行醛还原。 然而，由于严重的剥离副反应，所得聚糖产物不能在还原端进一步衍生化或产率低。 最近发现家用漂白剂会释放糖蛋白中所有类型的 N-聚糖和 O-聚糖，以及鞘糖脂中的聚糖腈。 然而，观察到了副反应，且需要额外标记步骤来进一步纯化和功能化。 由于聚糖上缺乏天然发色团、还原末端异构旋转以及质谱 (MS) 灵敏度低，在高效液相色谱 (HPLC) 分离过程中监测聚糖具有挑战性。 此外，聚糖微阵列的制备通常需要用功能基团对聚糖进行衍生化。 因此，在释放的聚糖上添加适用的荧光标签可以更轻松、更有效地分离和固相固定。 聚糖微阵列的荧光标签可以使用 2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、2,6-氨基吡啶和 N-氨基乙基 2-氨基苯甲酰胺 (AEAB) 通过还原胺化来连接，或通过使用 2- 氨基甲基 N,O-羟乙基 (AMNO)、N-Fmoc-3-（甲氧基氨基）丙胺 (F-MAPA)和 O-苄基羟胺（ BHA）的N-烷基肟缩反应连接。 这些标签已用于生成聚糖文库，并成功应用于筛选聚糖结合蛋白（GBP）。 还原聚糖通常通过两步过程用双功能试剂进行化学衍生化获得。 最近，报道了一种新的一锅法，用于非还原性β-消除释放和 O-原位标记。 使用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮 (PMP) 从糖蛋白中提取聚糖。通过这些方法，两个主要步骤，非还原释放和标记，可以同时进行，从而简化了聚糖制备的样品处理。 此外，双-PMP聚糖衍生物在254 nm处表现出强烈的紫外线（UV）吸收，并且比其天然形式具有更高的疏水性，这有利于HPLC分离和UV检测。 然而，这些方法不会产生带有功能基团的聚糖来固定到载玻片上以产生微阵列。
 
该研究团队提出了一种使用新型吡唑啉酮型异双功能标签2-(4-(3-甲基-5-氧代-4,5-二氢-吡唑唑-1-基)苯基)乙腈(ANPMP)的综合方法 ，能够对N/O-聚糖进行一锅法释放并同时捕获、分离、结构表征和功能分析。 该标签被设计为包含活性亚甲基和氰基功能基团。 在碱性条件下，它可以通过激活活性亚甲基与聚糖缀合，而氰基在聚糖 ANPMP 标签缀合过程中保持稳定，但之后可以转化为活性氨基，以便有效固定在活化固相上用于制造聚糖微阵列。使用 ANPMP 在碱性介质中开发了一种高效、通用的先进一锅法释放和标记 N/O-聚糖和游离天然还原聚糖的方法，以验证这些假设。 随后，将聚糖-2ANPMP缀合物方便地转化为聚糖-AEPMP（2-（4-（3-甲基-5-氧代-4,5-二氢-吡唑唑-1-基）苯基）乙胺）缀合物（聚糖-AEPMP） ，含有活性氨基的物质，通过HPLC分离，通过ESI-MS与MSⁿ技术进行结构表征，并制备成标记聚糖文库。 此外，高纯度聚糖-AEPMP 通过其游离烷基胺共价固定在 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯活化的载玻片上，以生成鸟枪式天然聚糖微阵列，并进行功能研究。
 
   
           方法概述，用于制备糖基-AEPMP共轭物，并生成用于与凝集素和血清样本进行研究的鸟枪式天然聚糖微阵列。
 
 
微阵列制备和检测方法，详述如下。AEPMP 标记的聚糖在磷酸盐缓冲液（100 mM 磷酸钠，pH 8.5）中重新溶解， 最终浓度为100 μM，并点样到NHS-酯活化的载玻片上。 使用配备 PDC 80 压电式喷头（Scienion GmbH，柏林，德国）的 sciFLEXARRAYER S3 非接触式点样仪将聚糖喷点到载玻片上（每张载玻片上有 16 个子阵列）。 为每个聚糖打印四个重复点。 所有聚糖微阵列均打印为每张载玻片16 个子阵列，每个子阵列 336 个点。 液滴体积405 pL，并且打印缓冲液作为阴性对照。 打印后，载玻片在相对湿度设定为 65% 的加湿柜中于 25°C 下孵育，使聚糖与载玻片结合过夜。 然后将打印的载玻片用含有25 mM乙醇胺的100 mM 四硼酸钠缓冲液（pH = 9.0）在 55 °C 下封闭 2 小时，使用 MilliQ 水洗涤两次，干燥，并保存在 -20 °C 直至使用。
 
在微阵列检测之前，通过安装ProPlate 16孔微阵列模块将每个子阵列分隔开，并使用100 μL TSMTB缓冲液（20 mM Tris.HCl，150 mM氯化钠，0.2 mM氯化钙，0.2 mM氯化镁，0.05％（v/v）Tween®20，1％（w/v）BSA，pH 7.4）重新水合10分钟。进行分析时，吸除TSMTB缓冲液，并加入100 μL 含GBPs的PBST缓冲液或含适当浓度血清样本的TSMTB缓冲液。微阵列载玻片用明确定义的生物素化凝集素和血清样本进行探测。将载玻片密封并在轻柔摇动下孵育2小时，然后用PBST和PBS缓冲液洗涤四次。接下来，向每个子阵列添加100 μL荧光标记的二抗或Cy3-偶联链霉素（Cy3-SA），密封并在轻柔摇动下孵育1小时。生物素化凝集素（Vector Labs）除AAL和Con A外，均以10 μg/mL进行分析（AAL和Con A以1 μg/mL进行分析），结合的凝集素通过与Cy3-SA（1.0 μg/mL；Solarbio）的二次孵育进行确认。采用Alexa Fluor 488-偶联的兔抗人IgG（5 μg/mL；SouthernBiotech）和Alexa Fluor 488-偶联的山羊抗人IgM（5 μg/mL；Abcam）用于检测结合情况。孵育后，载玻片依次用PBST、PBS缓冲液和MilliQ水洗涤四次，然后经过简短离心干燥以进行扫描。使用来自Innopsys公司（法国）的InnoScan 710-G微阵列扫描仪对载玻片进行成像。获得的图像使用Innopsys公司Mapix 8.5微阵列分析软件进行分析，然后使用Microsoft Excel处理以获取微阵列结果。在手动对齐每个子阵列与绿色通道中微弱可见的聚糖斑点后，进行信号定量。以下方程计算信号：平均数据=四个重复荧光强度均值-背景强度荧光强度均值。从至少三个独立实验计算变异系数。
   
 
 
 
文献原文链接：  https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121617