植物活体成像助力发现NRPD4与RNA聚合酶IV和V的关系

 https://genesdev.cshlp.org/content/23/3/318

研究背景

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DNA甲基化是一种表观遗传学标记，保存在植物、哺乳动物和一些真菌中。它在表观遗传过程中发挥重要作用，如转基因和内源基因的稳定转录沉默、参数化、印迹和X失活。在植物中，24核苷酸（nt）siRNAs可以指导序列特异性DNA甲基化。哺乳动物细胞中，piwi-interacting small RNAs（piRNAs）和某些内源性siRNAs也可以指导DNA甲基化。在裂殖酵母中，没有DNA甲基化，但是siRNAs仍然可以通过指导异染色组蛋白修饰来触发转录基因沉默（TGS）。

植物异染色质siRNAs长度为24nt，其产生途径依赖于RNA依赖的RNA聚合酶2（RDR2）和Dicer-like3（DCL 3）。该途径还需要PolIV，一种植物特有的，推测为DNA依赖性RNA聚合酶。有趣的是，siRNAs的功能不仅取决于效应蛋白Argonaute 4（AGO4）,染色质重塑蛋白DRD1和新的DNA甲基化转移酶DRM2，还取决于另一种植物特有的推测为DNA依赖性RNA聚合酶Pol IVb/PolV。PolIV被推测为转录甲基化DNA，以产生作为RDR2底物的初始转录物。然而，无论在体内还是体外这种活性尚未得到证实。最近，PolV和DRD1被发现是产生无帽和非聚腺苷化RNAs所必需的，这些RNAs可以作为异染色质siRNAs结合的支架，而异染色质siRNAs是DNA甲基化的特异性向导。    

在ros1突变体中，nrpd4-1突变抑制TGS

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除了已知的7个基因突变体外，一种新的突变体rdm2-1（后来被重命名为nrpd4-1或nrpe4-1）也被鉴定为ros1抑制因子。图2A显示了野生型、ros1和ros1nrpd-1的发光表型。结果显示，经过冷处理后，ros1nrpd4-1发出的发光强与ros1相比，尽管其发光仍弱于野生型。结果表明，ros1中的RD29A-LUC的沉默部分受到nrpd4突变抑制。

ros1nrpd4-1植株的发光表型表明，nrpd4-1突变抑制了RD29A-LUC转基因的TGS。Northern blot检测显示，内源性RD29A mRNA水平高于ros1，但低于野生型（图2B）。这些结果表明，nrpd4-1突变部分抑制了RD29A-LUC转基因和内源性RD29A基因的沉默。野生型、ros1和ros1nrpd4-1植株在18S rRNA负载控制或冷胁迫诱导的COR15A基因冷处理控制方面没有差别（图2B）。综上所述，这些结果表明nrpd4-1突变部分抑制内源RD29A和RSD29A-LUC转基因的TGS。  

TGS在ros1nrpd4-1突变体中受到抑制

NRPD4/NRPE4与NRPD1和NRPE1相互作用

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由于NRPD4/NRPE4和PRB4之间的高度相似，以及我们发现NRPD4/NRPE4在RdDM通路中的功能，我们想知道NRPD4是否可能是POl IV和/或Pol V的一个功能亚基，我们进行了免疫共沉淀实验来检测NRPD4/NRPE4与POl IV或Pol V的最大亚基的关联。从NRPD1-Flag转基因植株、NPRE1-Flag转基因植株或未转基因的野生型植株中提取蛋白质与抗NRPD4/NRPE4抗体孵育，然后用蛋白A琼脂糖珠沉淀。将结合蛋白复合物洗涤后洗脱，用抗Flag抗体进行Western blot分析，检测NRPD1a/NRPD1或NRPD1b/NRPE1是否与NRPD4/NRPE4免疫共沉淀。分析显示NRPD1-Flag（图8A）和NRPE1-Flag（图8B）都可以被NRPD4/NRPE4抗体共沉淀。结果表明，NRPD4/NRPE4在体内可以与NRPD1和NRPE1相互作用。因此，NRPD4/NRPE4可能在POl IV和Pol V中作为亚基起作用。

NRPD4/NRPE4与NRPD1和NRPE1相互作用          

研究结果

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证明了RDM2不是RPB4的直系同源，相反，它是PolIV和PolV的一部分；Pol IV和PolV是多亚基酶，NRPD4/NRPE4亚基是从PolII的祖先RPB4亚基进化而来的，但是已经分化为承担RdDM途径的特定功能。

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植物突变体筛选（低温CCD相机检测）、RNA印迹、酵母双杂交、DNA甲基化测定、RT-PCR分析、免疫共沉淀和免疫印迹法、免疫染色等。

小编感悟：初次写类似文字，自身有很多不足，会在今后努力提高的。欲善其事，必先利其器。新基因、机制的发现，不只是需要专业的人才，严谨的实验设计，专业的检测设备也是不可缺少的。 

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