RT-PCR实验RNA提取及质量确认方法盘点
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RNA提取：
1. 收集目的菌体；
2. 研钵置于180℃烘箱3小时，备用；
3. 采用液氮低温研磨15分钟至菌体破碎，可通过镜检查看菌体破碎效果，该过程避免破碎时间过久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混匀后转移至RNase free的EP管中；
5. 在每管样品中加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C离心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的无水乙醇，吹打混匀；
8. 将上述700 μL混合液转移至吸附柱中，12000 rpm离心30 s，弃废液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液；
10. 重复步骤9；
11. 12000 rpm离心2 min后，把吸附柱转移到新的EP管；
12. 开盖后，室温放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，静置1分钟；
14. 12000 rpm，4℃离心1 min，将含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后续的浓度测定以及质量检测，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，备用。
RT-PCR实验RNA的质量确认方法：
1、检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3、保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验基本上就成功了！
RNA提取：
1. 收集目的菌体；
2. 研钵置于180℃烘箱3小时，备用；
3. 采用液氮低温研磨15分钟至菌体破碎，可通过镜检查看菌体破碎效果，该过程避免破碎时间过久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混匀后转移至RNase free的EP管中；
5. 在每管样品中加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C离心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的无水乙醇，吹打混匀；
8. 将上述700 μL混合液转移至吸附柱中，12000 rpm离心30 s，弃废液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液；
10. 重复步骤9；
11. 12000 rpm离心2 min后，把吸附柱转移到新的EP管；
12. 开盖后，室温放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，静置1分钟；
14. 12000 rpm，4℃离心1 min，将含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后续的浓度测定以及质量检测，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，备用。
RT-PCR实验RNA的质量确认方法：
1、检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3、保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验基本上就成功了！
