荧光定量PCR实验方法和应用介绍
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
在常做的QPCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。
相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的Ct值与对照样本的Ct值进行比较，结果用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在qPCR定量检测RNA水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响。
绝对定量常用于精确计算初始模板中目的基因的浓度，比如测定血液样品中病毒颗粒数（DNA或RNA）,细胞中基因的拷贝数等，得到的数据是单个样本的定量描述，不依赖于其他样本。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，这种关系表现为标准曲线，绝对定量的检测即根据标准曲线对未知样品进行的定量。
一、实验方法
1.RNA提取
（1）目前最常用的RNA提取方法就是trizol法，具有极强的裂解能力，可以在短时间内充分裂解细胞或者组织样本，保持RNA的完整性，有效抑制RNA的降解；目前市面上还有很多成品的常用RNA提取试剂盒，均是如此原理。
2.具体步骤
（1）拿出冻存组织或者新鲜组织，称重，充分液氮研磨；
（2）加入1ml trizol或者其他成品裂解液，充分混匀后放置震荡摇匀上5-10min，使样本充分裂解；
（3）4℃，13000rpm离心5min后，吸取上清转移至新1.5ml离心管中；
（4）加入预冷氯仿后，迅速剧烈震荡30s-60s，静置5-10min后，4℃离心；
（5）此时离心管中液体分为三层，吸取最上层水溶液转移新离心管中；
（6）加入等体积异丙醇，充分混匀后，静置5-10min后，4℃离心；
（7）弃上清，对管底白色沉淀加入预冷75%乙醇，混匀清洗后，4℃离心，弃上清；
（8）吹干沉淀后，加入DEPC水溶液，测浓度，-80摄氏度保存。
3.RNA浓度测量
一般使用nanodrop就可以测量，观察260/280在1.8-2即可；此外也可以进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现明显拖带RNA可能降解；
4.反转录
（1）RNA自身是无法作为PCR反应的模板的，需要先将其反转录为cDNA，在进行QPCR检测；
（2）通常根据RNA浓度，每个样本量取固定3ug/5ug的RNA进行反转录，加入反转录试剂盒中配套的试剂，在固定温度进行；得到的cDNA稀释同倍数后，-80℃保存。
5.实时荧光定量PCR检测
（1）常规认为相同RNA的量进行的反转录，得到的cDNA不需要调整浓度，在上机检测PCR时取相同体积cDNA进行，一般取2-4ul均可。
（2）如果是做绝对定量，则上述需要增加标准品即可；如果是做常规mRNA，内参插管选择actin或者GAPDH即可；若检测的是特殊的micRNA等，内参常规使用U6。
（3）常见案例
在常做的QPCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的Ct值与对照样本的Ct值进行比较，结果用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在qPCR定量检测RNA水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响。
绝对定量常用于精确计算初始模板中目的基因的浓度，比如测定血液样品中病毒颗粒数（DNA或RNA）,细胞中基因的拷贝数等，得到的数据是单个样本的定量描述，不依赖于其他样本。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，这种关系表现为标准曲线，绝对定量的检测即根据标准曲线对未知样品进行的定量。
一、实验方法
1.RNA提取
（1）目前最常用的RNA提取方法就是trizol法，具有极强的裂解能力，可以在短时间内充分裂解细胞或者组织样本，保持RNA的完整性，有效抑制RNA的降解；目前市面上还有很多成品的常用RNA提取试剂盒，均是如此原理。
2.具体步骤
（1）拿出冻存组织或者新鲜组织，称重，充分液氮研磨；
（2）加入1ml trizol或者其他成品裂解液，充分混匀后放置震荡摇匀上5-10min，使样本充分裂解；
（3）4℃，13000rpm离心5min后，吸取上清转移至新1.5ml离心管中；
（4）加入预冷氯仿后，迅速剧烈震荡30s-60s，静置5-10min后，4℃离心；
（5）此时离心管中液体分为三层，吸取最上层水溶液转移新离心管中；
（6）加入等体积异丙醇，充分混匀后，静置5-10min后，4℃离心；
（7）弃上清，对管底白色沉淀加入预冷75%乙醇，混匀清洗后，4℃离心，弃上清；
（8）吹干沉淀后，加入DEPC水溶液，测浓度，-80摄氏度保存。
3.RNA浓度测量
一般使用nanodrop就可以测量，观察260/280在1.8-2即可；此外也可以进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现明显拖带RNA可能降解；
4.反转录
（1）RNA自身是无法作为PCR反应的模板的，需要先将其反转录为cDNA，在进行QPCR检测；
（2）通常根据RNA浓度，每个样本量取固定3ug/5ug的RNA进行反转录，加入反转录试剂盒中配套的试剂，在固定温度进行；得到的cDNA稀释同倍数后，-80℃保存。
5.实时荧光定量PCR检测
（1）常规认为相同RNA的量进行的反转录，得到的cDNA不需要调整浓度，在上机检测PCR时取相同体积cDNA进行，一般取2-4ul均可。
（2）如果是做绝对定量，则上述需要增加标准品即可；如果是做常规mRNA，内参插管选择actin或者GAPDH即可；若检测的是特殊的micRNA等，内参常规使用U6。
（3）常见案例
