妊娠中期小鼠神经发育的空间全转录组特征分析

哺乳动物神经系统的发育是一个复杂的过程，在空间和时间上受基因表达的精确调控。对驱动神经系统发育的转录组研究，传统方法主要采用低靶标数的原位技术或者对离体胚胎进行单细胞转录组测序，但随着空间多组学技术的迅猛发展和成熟应用，目前研究人员可以实现在保留组织空间结构的基础上，对组织切片中任何感兴趣的区域（ROI）进行全转录组（～2万个基因）或者蛋白质组（570多种蛋白质）的检测和探究。

在2023美国神经学年会（SfN）上展示的一项研究中，研究人员利用GeoMx®空间多组学技术对健康C57BL/6小鼠胚胎E9-E15四个时间点上的小鼠中枢神经系统（CNS）和肠道神经系统（ENS）的特定解剖学组织亚结构进行了形态表征和全转录组检测分析。研究人员观察到不同空间位置的组织区域具有特异性的表达谱特征。这些结果为发育中的中枢神经系统和肠道神经系统关键结构的基因表达提供了丰富的时空图谱，为神经疾病尤其是神经发育障碍研究提供了重要参考。
 

研究摘要

研究人员利用GeoMx® DSP对重点关注的神经组织区域中的75个感兴趣区域（ROI）进行了全转录组的检测分析。使用开源的GeomxTools R软件包进行了LMM差异表达检测和相关性分析。

样本组织：分别处于E9、E11、E13和E15期的四只健康C57BL/6小鼠胚胎的新鲜冷冻矢状组织切片（5µm厚），共17个组织样本。

检测方法：GeoMx小鼠空间全转录组检测方案（GeoMx® Mouse WTA）：包含~20,000个蛋白编码基因。

组织形态学标记：荧光标记的β3微管蛋白和p63蛋白来分别标记神经元和上皮细胞。

 

GeoMx® DSP工作流程

定量试剂：针对每个靶标RNA都设计了特异性探针，探针序列包括与靶标RNA特异性结合的捕获序列；与靶标RNA一一对应的独特分子标识条码；以及将这两段偶联在一起的光可裂解的链接子。

成像试剂：荧光标记的抗体或RNA，用于展示组织的形态学特征，标记组织中特定的细胞类型或组织区域。

GeoMx采用了和标准免疫组化或原位杂交方法类似的样本处理流程。具体将成像试剂（带有荧光的形态学标记）、定量试剂（所有靶标的特异性探针）与组织切片进行共杂交。根据形态学标记所展现出的组织结构可以指导ROI的圈选。GeoMx® DSP仪器内置的百万级微镜阵列可以被数字化调控形成特定的反射面，进而将自下而上发射的紫外光反射为契合每个ROI形状的紫外光束，精准地照射至该ROI区域，使得该区域中所结合的定量探针中的光可裂解链接子断裂，其后端偶联的分子标识条码得以释放，并及时地被上端极细的微针吸取收集至收集板特定的孔中。当所有的ROI照射和收集完毕后，进行测序文库构建和高通量测序获取每个靶标的表达量。

从新鲜冷冻固定组织圈选感兴趣区域（ROI）

在中枢神经系统中，研究人员在前脑的三个矢状切面上选取了25个ROI，并确定了E9发育期在端脑和间脑区域中表现出显著差异表达的83个基因。这些基因中包含对神经元命运决定至关重要的形态发生因子。

与中枢神经系统相比，肠道神经系统的研究相对较少，因此研究人员在6个矢状切面肠道神经元层上额外选择了20多个组织区域（ROI），进行了进一步分析。研究人员观察到，不同ROI中广泛的转录差异取决于它们在肠道中的位置，也就是说肠道中不同空间位置的组织区域具有特异性的表达特征。

每个时间点的组织切片示例。彩色几何图形表示所分析的感兴趣区域（ROI），一种颜色表示一个独特的ROI。从17种组织中对圈选的733个感兴趣区（ROI）进行分析：躯体、大脑、十二指肠、食道、前肠、心脏、肾脏、肢芽、肺、中肠、神经管、胰腺、咽部、胎盘、皮肤、胃和气管。其中75个脑、神经管和肠ROI主要是神经细胞或部分神经细胞。

ROI大小范围从1,400到180,000 µm2不等，平均每个ROI包含288个细胞。神经ROI范围从4,000到110,000 µm2不等，平均每个ROI包含472个细胞。
 

神经元基因表达

对精选的1,000个重点关注基因在75个ROI中的表达分析

 

发育中端脑和间脑的转录差异

E9阶段间脑（MES，n=8 ROIs）和端脑（TEL，n=10 ROIs）之间的基因表达差异。

与神经元发育和分化有关的基因

 

肠道神经系统及其周围细胞的基因表达

显示了E13阶段肠道中涉及神经元分化的四个基因的空间分布。每个ROI均以归一化基因表达量进行着色，箭头指向神经元丰富的最外层 ROI。中肠ROI显示在每张图像的左上部分，胃ROI显示在每张图像的右下部分。

 

小结

GeoMx® DSP可对小鼠胚胎多个发育时期的多个组织中700多个感兴趣区域进行分析；

与胚胎神经元发育和分化有关的部分基因在E9期端脑和间脑区域之间出现差异表达；

通过分析整个转录组，还得到了一些意想不到的新发现，比如发现Irx5等基因在不同脑区之间有不同的表达。该基因已知有助于产后神经发生，但在胚胎脑发育过程中却未被描述过；

在ENS神经元和邻近细胞中，观察到各组织之间存在广泛的转录差异，这些组织共同构成了肠道。

 

GeoMx® DSP 空间多组学分析系统

GeoMx® Digital Spatial Profiler（DSP）空间多组学平台结合了组织影像分析和原位定量技术，可在展示全局组织结构的基础上，进一步实现从复杂组织中对细胞亚群或特定结构的精准分析。在获得高分辨率的样本空间信息的同时实现高靶标蛋白（>570种蛋白质）和全转录组（~20000个基因）空间原位表达谱的精准获取。最新的DSP工作流程可以支持在一张组织切片上同时检测蛋白质和RNA的空间原位表达信息。GeoMx® DSP兼容多种组织样本类型（如FFPE、新鲜冻存样本等），成为基础科研、转化医学研究和临床实践探究中强大有力的工具，使不同领域（如肿瘤学、免疫疾病、神经科学、药物研发等）的研究人员能够深入洞察组织微环境、功能亚结构、免疫系统作用机制和生物标志物发掘，满足不同阶段的研究和应用需求！