免疫印迹WB实验常见封闭液的特性介绍
Western Blot，也就是我们通常所说的“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
封闭是Western Blot 至关重要的一部分， 所以正确的封闭液选择可以让抗体更特异地和抗原结合，为成功的WB奠定基础。虽然这个步骤操作简单，但是封闭液的选择确是很多科研人员的难题。为了让大家更方便的选择适合自己实验的封闭液，这里介绍6种常见不同的封闭液，以及它们的优缺点。
封闭液的选用要求：
1、常用封闭液为脱脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、无蛋白封闭液等。
2、封闭液浓度：封闭时一般用5%脱脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%无蛋白封闭液；配制二抗稀释液一般为1-5%脱脂牛奶，全部用PBS稀释。
3、封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时。
4、封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封闭液和稀释抗体的封闭液需要调pH至7.4；但是大多数抗体不调pH也可以做出来。
5、个人经验：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。
常见封闭液：
1、脱脂奶粉
最yi宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。无论是从化学制品公司还是从超市购买，都可以直接拿来使用。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。
2、牛血清白蛋白(BSA)
牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可 以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究人员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有 可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号 。
3、全血清
全血清是许多蛋白质的混合物，例如胎牛血清、兔血清、山羊血清等，同样可以被用来当做封闭剂。大家对它的使用率很低，因为跟脱脂奶粉和BSA相比，并没有什么突出的好处，但价格却更贵。通常使用的浓度为 5-10%（w/v）。像BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，会和哺乳动物抗体产生交叉反应。
4、鱼胶
用鱼胶当封闭液是从猪皮胶演变而来的。鱼胶是从冷水鱼的皮肤中提取出来的，即使在温度较低的情况下也会不会凝固。通常使用的浓度为0.1-5% （w/v）。不像脱脂奶粉和BSA，它不含有任何的血清蛋白，所以就不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，大大降低了背景信号。但是鱼胶不能用来封闭生物素- 抗生物素抗体蛋白系统，因为它含有内源性生物素。
5、聚乙烯吡咯烷酮
PVP 是传统封闭液的非蛋白质性质的替代品。虽然早在1993年就有文献发表，在封闭技术上却是很新的产品。PVP是一种水溶性多聚物，可以很快和硝酸纤维素和PVDF膜结合。通常使用的浓度在0.5-2%（w/v），而且通常会和其他封闭剂一起使用。PVP 在用于检测较小目标蛋白的时候非常有效。
6、商品化封闭液
商品化封闭液通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题，而且封闭时间很快。
相信大家现在对各种封闭液都有了更全面的了解。总的来说，封闭液的选择基于三样事情：抗体、目标蛋白和检测系统。但是要想找到适合自己目标蛋白的封闭液，并不简单。除了排出一些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。
封闭是Western Blot 至关重要的一部分， 所以正确的封闭液选择可以让抗体更特异地和抗原结合，为成功的WB奠定基础。虽然这个步骤操作简单，但是封闭液的选择确是很多科研人员的难题。为了让大家更方便的选择适合自己实验的封闭液，这里介绍6种常见不同的封闭液，以及它们的优缺点。
封闭液的选用要求：
1、常用封闭液为脱脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、无蛋白封闭液等。
2、封闭液浓度：封闭时一般用5%脱脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%无蛋白封闭液；配制二抗稀释液一般为1-5%脱脂牛奶，全部用PBS稀释。
3、封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时。
4、封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封闭液和稀释抗体的封闭液需要调pH至7.4；但是大多数抗体不调pH也可以做出来。
5、个人经验：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。
常见封闭液：
1、脱脂奶粉
最yi宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。无论是从化学制品公司还是从超市购买，都可以直接拿来使用。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。
2、牛血清白蛋白(BSA)
牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可 以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究人员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有 可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号 。
3、全血清
全血清是许多蛋白质的混合物，例如胎牛血清、兔血清、山羊血清等，同样可以被用来当做封闭剂。大家对它的使用率很低，因为跟脱脂奶粉和BSA相比，并没有什么突出的好处，但价格却更贵。通常使用的浓度为 5-10%（w/v）。像BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，会和哺乳动物抗体产生交叉反应。
4、鱼胶
用鱼胶当封闭液是从猪皮胶演变而来的。鱼胶是从冷水鱼的皮肤中提取出来的，即使在温度较低的情况下也会不会凝固。通常使用的浓度为0.1-5% （w/v）。不像脱脂奶粉和BSA，它不含有任何的血清蛋白，所以就不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，大大降低了背景信号。但是鱼胶不能用来封闭生物素- 抗生物素抗体蛋白系统，因为它含有内源性生物素。
5、聚乙烯吡咯烷酮
PVP 是传统封闭液的非蛋白质性质的替代品。虽然早在1993年就有文献发表，在封闭技术上却是很新的产品。PVP是一种水溶性多聚物，可以很快和硝酸纤维素和PVDF膜结合。通常使用的浓度在0.5-2%（w/v），而且通常会和其他封闭剂一起使用。PVP 在用于检测较小目标蛋白的时候非常有效。
6、商品化封闭液
商品化封闭液通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题，而且封闭时间很快。
相信大家现在对各种封闭液都有了更全面的了解。总的来说，封闭液的选择基于三样事情：抗体、目标蛋白和检测系统。但是要想找到适合自己目标蛋白的封闭液，并不简单。除了排出一些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。
