InnoScan文献：基于微阵列芯片的新冠变异株多重高效检测详解

自2019年 12月出现 COVID-19 大流行以来，SARS-CoV-2 病毒不断演变为世界各地出现的许多变种。目前，主要采用两种方法来识别 SARS-CoV-2 变异株：通过测序对完整病毒基因组进行测序，以及定量逆转录 PCR。尽管基因组测序非常准确并可识别任何突变，但常规基因组测序成本高、耗时，且需专门设备与生信解读。相比之下，基于PCR 技术，例如定量 PCR 、熔解温度 RT-PCR 和基于 CRISPR-Cas13a 的转录扩增 ，可同时识别单个或少数突变（4 个，最多 5 个，因可用荧光通道数量有限）。因此，迫切需要开发一种简单、灵敏、快速的检测方法，以同时准确识别多种变异株。意大利科学家最近开发了一种基于微阵列的检测方法，通过同时检测刺突蛋白基因突变来区分临床样本中存在的已知病毒变异株。
SARS-CoV-2 正链 RNA 基因组大小约为 30 kb，编码 29 种蛋白质，突变率约为每月两次非同义突变。在疫苗快速开发的早期，因首波流行大量患者死亡，新变种免疫逃逸并未被视为优先事项。在影响免疫逃逸变异株各因素中，免疫功能低下人群中观察到的长排毒期,是突变逃逸因素之一。

临床显著突变主要发生在刺突蛋白（S 蛋白，图1），这是一种介导靶细胞识别和融合的三聚体包膜糖蛋白。 S蛋白结构任何改变都可能影响病毒感染，并最终决定病毒选择性优势，影响不同变体感染动力学。导致全球大多数感染的五种变异株是 B.1.1.7（ Alpha 变种）、B.1.351（Beta 变种）、B.1.1.28（Gamma 变种 ）、B.1.617.2（Delta 变体）和更大谱系 B.1.1.529（Omicron1、Omicron2 和 Omicron5 变体）。
  图 1. (a) 刺突蛋白由三个刺突单体组成，在 SARS-CoV-2 表面形成同源三聚体结构（刺突三聚体）。每个单体分为两个亚基，即 S1 和 S2，在弗林蛋白酶切割位点连接。在病毒融合过程中，S1 亚基中的受体结合域 (RBD) 与宿主细胞靶受体 ACE2 结合，而 S2 则实现膜融合。 (b) SARS-CoV-2 S蛋白S1亚基的示意图和氨基酸序列。每个变体中存在的突变位置，包括 扩增子1（S 蛋白编码序列中的位置 23 至 289 nt）和 扩增子2（S 蛋白编码序列中的位置 1215 至 1545 nt）。 S1：胞外域S1亚基； S2：胞外域S2亚基； NTD：N 末端结构域；RBD：受体结合结构域；RBM：受体结合基序； CTD：C 端结构域。
 
 
 
在该研究中，该研究团队设计双域核酸探针，区分域用于特异性结合S蛋白突变序列PCR扩增产物（表一），编码结合域能与芯片表面捕获探针特异结合（表二和图二）。PCR产物标有Cy3染料，可被荧光扫描仪检测。（图三）。    
图 2. 实验示意图。 (a) 在 L452R 突变的情况下（包含点突变的核苷酸三联体以黄色突出显示，突变以红色突出显示），L452R 双域核酸探针在溶液中与 Cy3 标记的单链 PCR 杂交，而 L452 Wt 报告基因则无杂交。 (b) 双域核酸探针 3' 不同编码的结合域（不同颜色代表序列差异）通过与芯片表面相应捕获探针杂交将标记的 PCR产品结合到微阵列芯片不同位置。 (c) 将 Cy3-标记的反向引物整合到 PCR 扩增子中，通过InnoScan710荧光扫描仪检测S 蛋白基因突变。该图显示L452R 突变的样品点信号强，非突变 L452 Wt的样品点无信号。
 
   
图 3.(a)  双域核酸探针和Cy3 标记的多重PCR扩增产物示意图。双域核酸探针的区分域小黑 x 表示突变。人 β-肌动蛋白扩增子 (Amplicon3) 直接与微阵列表面捕获探针杂交。 (b) Omicron BA.1、BA.2 和 BA.5 亚变体的特定突变特征。检测到的突变株显示在列中，子变株显示在行中。每个Omicron 亚变体都可通过特定突变组合模式来识别。 (c) 微阵列点样方案。 (d) 四个硅芯片 Cy3 荧光图像。携带 BA.1、BA.2、BA.5 亚变株和无 DNA 模板对照 (NTC) 样品的 Cy3 标记 PCR产物（扩增子1、2 和 3）与双域核酸探针抚育，然后进行芯片杂交。图中黄色方块用于突出显示杂交斑点。斑点大小为 400 μm，间距为 800 μm。
 
      这种高特异性多重检测实验可对引起全球感染浪潮的病毒变异株进行基因分型。该实验的灵活性允许通过增加捕获探针和双域核酸探针来检测新变异株。
   
 
 
 
文献原文链接：  https://doi.org/10.3390/bios13020269