免疫组化IHC实验流程介绍
免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术IHC (immunocytochemistry) 是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体 (或抗原) 对组织内抗原 (或抗体) 的分布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片（标本制作的 shou 选方法）和冰冻切片。一般而言，石蜡切片要求薄厚均匀，切片完整，且无褶无刀痕，相当考验实验人员的刀工，建议找专业培训过的人员或公司进行切片。
1、脱蜡与水化：将石蜡切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接对着切片冲洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片 30 min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新「满血复活」。
小鱼常用的是微波修复，pH 6.0 的 0.01M 柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复 2 次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用「zhu 传」的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃ 温箱中 30 min, 用滤纸吸去多余的血清。
5、孵育一抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的一抗 20ul，4℃ 过夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 过夜后，需要将切片放置 37℃ 复温 45 min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）
6、孵育二抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片显色：用 DAB-H2O2 显色 10 min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10 min 内即可用蒸馏水终止显色。
8、复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用 Mayer 苏木素染色 30s，水洗，盐酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性树胶封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度）。
免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片（标本制作的 shou 选方法）和冰冻切片。一般而言，石蜡切片要求薄厚均匀，切片完整，且无褶无刀痕，相当考验实验人员的刀工，建议找专业培训过的人员或公司进行切片。
1、脱蜡与水化：将石蜡切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接对着切片冲洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片 30 min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新「满血复活」。
小鱼常用的是微波修复，pH 6.0 的 0.01M 柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复 2 次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用「zhu 传」的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃ 温箱中 30 min, 用滤纸吸去多余的血清。
5、孵育一抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的一抗 20ul，4℃ 过夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 过夜后，需要将切片放置 37℃ 复温 45 min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）
6、孵育二抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片显色：用 DAB-H2O2 显色 10 min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10 min 内即可用蒸馏水终止显色。
8、复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用 Mayer 苏木素染色 30s，水洗，盐酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性树胶封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度）。
