空间转录组测序常见问题和解决方案

空间转录组测序

常见Q&A合集

Part.01 样品

Q1：空间转录组适用的样品类型？

新鲜样本可以适用于多个物种，包括：人类、小鼠、大鼠、斑马鱼；FFPE样本仅适用于人类和小鼠。

目前10x Genomics官方推荐的样本物种包括：

新鲜样本包括：人类（大脑、脊髓、心脏、乳房、乳腺、肺、淋巴结、肾脏、大肠-结直肠癌、卵巢、脾脏等）、鼠（大脑、眼睛、心脏、脊髓、股四头肌、眼睛、肺、甲状腺、肝脏、脾脏、胃、肾脏、大肠、小肠、睾丸、卵巢、嗅球、肱四头肌、舌头等）；  

FFPE样本包括：人类（大脑、胸部、宫颈、心脏、脊柱、脊髓、肺、淋巴结、脾、前列腺、皮肤、肠、子宫等），小鼠（大脑、心脏、肝、脾、肾、睾丸、胸腺、胚胎、肌肉、子宫、胎盘、小肠、舌头以及皮肤等）。

若样本不在测试行列内，则需要进行评估。

对于FFPE样本，常规Visium只接收石蜡块组织样本；新推出的CytAssist产品可以兼容石蜡块、白片、预贴片或预染色的石蜡切片（10x标准中推荐的载玻片贴片）以及组织芯片（TMA）等多种样本类型。

Q2：确定做空间转录组的样本应该怎么处理？

（1）对于新鲜组织，处理和保存方法如下：

先冷冻后包埋法：新鲜组织样本取下后要迅速用预冷的镊子将新鲜组织浸没在异戊烷至组织完全冷冻，然后进行OCT包埋（尽量保持15min内）。若无异戊烷，也可直接进行OCT包埋。公司官网（https://www.shbiochip.com/）提供详细的OCT包埋教学视频，同时也提供不同型号的包埋盒，可根据需要进行选择。

🔸 样本能否直接液氮冻存？

不可以液氮直接速冻，直接液氮处理可能在沸腾过程中使组织周围形成空穴，导致不同区域降温不同步而改变内部形态，甚至组织碎裂。

🔸 若组织表面有血迹能否进行冲洗？

用预冷的PBS溶液或生理盐水进行冲洗，但冲洗后需要用干净的吸水纸吸干液体，防止形成冰晶，影响包埋。

（2）对于FFPE样本，处理及运输要求如下：

🔸 常规Visium ：

4℃密封保存运输石蜡块样本（建议用包埋盒送样，防止运输过程中样本损坏）。

🔸 CytAssist：

CytAssist不同类型FFPE样本送样要求

10x Genomics官方推荐的品牌玻片有效区域示意图

🔸 若石蜡切片单个样本切少于或超过5μm厚度，还能做空间转录组实验吗？

5μm是10x官方测试时采用并推荐的厚度，若实际组织超过或小于5μm，评估合格后也可做空间转录组，但可能会影响最终数据结果。

🔸 FFPE样本想要做空间转录组测序，最多保存多久？

推荐是保存在一年之内的样本，若超过一年，可以先取少量样本进行质量评估，若质检合格，也可进行空间转录组实验。因组织类型、时间和存放条件的不同，RNA的降解速度也会存在差异，因此仅依靠存放年限无法准确判断石蜡包埋块是否可用。目前是主要根据包埋块切片RNA的 DV200>50%（最新CytAssist要求DV200>30%）指标来确定（不论样本保存时间是否超过一年，都需要先进行质检）。

🔸 样本规格要求，是否超过6.5*6.5mm即无法做空间转录组？

根据芯片规格推荐样本大小在6.5*6.5mm之内，但是如果组织样本过大，对于新鲜样本现阶段可以提供两种解决方案：1）选取整个组织中感兴趣的区域（小于6.5*6.5mm），实验人员评估修片可行性，然后决定是否进行后续实验；2）若整个组织都为目标区域，则将组织分为两份，分别贴片到两个点阵进行后续实验。

常规Visium芯片规格

此外，10x 公司新推出的CytAssist，提供了两种芯片规格可供选择，分别为6.5*6.5mm和11*11mm，较大组织也可实现一次性检测，现在已经可用于FFPE样本实验，并且后续升级后也可应用于新鲜样本。

CytAssist芯片规格

新鲜/FFPE样本质检要求

Part.02 常规Visium 与CytAssist相比做了哪些更新？

Q1: 实验流程

🔸 常规Visium实验流程：

样本贴片于Visium芯片 ➡  脱蜡、HE染色、成像➡  探针杂交 ➡  建库和测序

🔸 CytAssist实验流程：

FFPE组织切片后贴于标准载玻片  ➡  脱蜡、染色、成像、解交联、探针杂交 ➡  CytAssist仪器中完成分析物转移 ➡  建库和测序

🔸 流程更新：

常规Visium的脱蜡、HE染色、成像以及探针杂交等步骤在Visium空间芯片上进行；CytAssist的脱蜡、染色、成像、解交联和探针杂交等步骤在标准载玻片进行，随后在Visium CytAssist仪器中进行明场成像以及完成分析物转移，无需进行多次切片贴片及粘附性测试实验，极大的简化了样本的处理。

常规Visium vs CytAssist实验流程对比

Q2: 其他

常规Visium vs CytAssist

Part.03 单细胞+空间联合分析

Q1: 空间转录组是单细胞分辨率的吗？

空间转录组的检测不是单细胞层面的，Visium芯片一个玻片上每个捕获区域面积为6.5mm*6.5mm（CytAssist提供了6.5mm*6.5mm和11mm*11mm两个规格芯片），每个点阵内有约5000个spot，根据样本类型不同，每个spot内的细胞数约1-10个细胞。Q2: 为什么要做空间转录组？

组织中除了细胞异质性，其空间分布对于疾病的发生发展也有重要的意义。单细胞测序能够鉴定组织中的细胞类型，但有时会发现对照组和处理组的细胞类型相似。以肿瘤为例，通过单细胞测序，可能在对照组和处理组都发现了相同的免疫细胞类型，而免疫细胞浸润对疾病的发展和预后具有明显的影响。因此，如果仅仅靠单细胞一个层面的数据，有时是很难解释清楚，此时细胞类型在组织的空间分布对于数据分析就显得尤为重要。通过结合空间转录组能够将不同细胞类型表达的marker基因映射到空间上，从而比较不同组织类型间细胞类型的空间分布特征。单细胞联合空间转录组分析不仅可以提高细胞类型注释的可靠性，还可以精确全面地揭示表达谱信息，特定细胞类型及其特定空间位置、特定生物学过程中的信号传导过程、细胞和细胞之间的通讯联系（在空间上是否真实分布在临近区域）。

此外，传统的FISH和IF虽然可以观察到病理组织的空间信息，但属于中低通量的检测，多用于筛选后的结果验证。

Q3: 如何跟单细胞联合分析？

（1）通过单细胞细胞类型鉴定结果辅助判定细胞的空间分布

通过分析单细胞数据，确定于疾病密切相关的细胞群，然后通过将单细胞注释到的细胞群marker基因图谱与空间数据进行关联分析，确定不同细胞类型的空间分布，为了解细胞类型的特定空间位置分布提供依据。

（2）对比不同分组间的空间结果，深入挖掘单细胞数据

🔸 分析不同细胞类型如何分布（在疾病区域、邻区或正常区域），确定空间结构是否具有明确区域划分；

🔸 通过分析转录组数据，不同区域之间是否有特异性的差异基因；

🔸 不同区域的细胞之间是否存在细胞互作关系，并联合特异性的差异基因功能分析，探讨细胞互作涉及的分子机制及通路，寻找疾病发病机制及治疗靶点。

Q4: 空间转录组测序和单细胞转录组测序一起进行联合分析，是否每个空转的样本都需要搭配相同样本的单细胞转录组？

如果空转的样本来自不同的患者，推荐每个患者各做一个单细胞测序。如果有几个空转的样本来自一个患者的同一个组织，可以这几个样本做一个单细胞，具体还需要根据不同的实验设计决定样本量，但是有一个基本前提：单细胞和空间样本在病理上出现的细胞类型是重合的。