Southern Blot实验方法和注意事项

实验原理：
Southern Blotting是将基因组总DNA酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离，变性之后利用虹吸原理印记到固相支持物上（如尼龙膜），然后与变性的同位素标记探针特异性地在一定温度下退火，最后根据同位素标记情况分析杂交结果的分子生物学技术。
 
实验目的：
Southern Blotting可用于多种实验目的，比如检测目的片段拷贝数，基因突变分析，限制性片断长度多态性分析等。
 
实验步骤：
1. DNA大样提取：
（1）取1g组织样本于液氮中迅速研磨成粉；
（2）将粉末转移至15ml离心管中，加入2ml煮沸的1.5Х CTAB（保持高温），65℃水浴30Min；
（3）加入2ml的氯仿/异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀25min，3000rpm离心15min；收集上清液于另一个15ml离心管中，加入200ul的10%CTAB（提前65℃温浴），再加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀20min，3000rpm离心15min；
（4）轻柔缓慢吸2ml上清于离心管，加入5ml 1%CTAB，上下缓慢颠倒充分混合均匀后，静置10分钟致絮状DNA聚集，3000 rpm离心15min;
（5）弃上清，加入1ml 1M NaCl溶液和1µl RNase的混合液，65℃溶解1d;（6）加入3ml预冷乙醇沉淀DNA，将沉淀转至1.5ml离心管中，之后用75%的乙醇洗涤沉淀，10000 rpm离心5min;
（7）弃上清，晾干后溶于50µl -100µl TE中，溶解至少1周（TE用于长时间保存DNA，若短时间可直接用双蒸水溶解）；
（8）取1µl用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的质量，剩余-20℃保存备用。

• DNA样本酶切

取DNA样本8-10ug，加酶25ul，酶切20h，随后每个样本取1-2ul进行0.8%TBE电泳胶跑胶检测，80V，3h；

• 转膜

配置1%转膜胶，加入干净的缓冲液为1×TAE，Loading Buffer 煮过的样本加样，0V，跑胶24-26h；

• 转膜后处理

待转完之后，小心取下盐桥上的所有装置，用镊子夹起膜，放在一张较大的滤纸上（可以包住膜的），放在一纸板内，置于80℃真空烘膜2h。待烘完膜之后便可以置于4度冰箱中冷藏或进行Southern blot。

• 杂交加探针

将Southern杂交液提前在65℃温浴，将膜放入一端封口的杂交袋（长约30cm）中，膜靠近封口的一端。 倒入65℃预热的杂交液，封口，置于杂交室65℃摇床，120rpm，6-12h；
加探针：从自封袋中取出杂交袋，从上方打开杂交带，加入探针后，封口，放入摇床中杂交12h以上，65℃，120rpm。

• 洗膜显影

将洗膜液倒入洗膜盒中，从摇床自封袋取出膜直接放入冷洗液中，清洗5min，倒掉洗膜液；
加热洗膜液至70℃，再次导入到洗膜盒中，热洗60-120s后，用镊子夹起膜，放入滤纸上吸干液体，用保鲜膜包住膜放入磷屏中压好，3h之后扫磷屏；
 
注意事项：
（1）探针设计和标记：引物的特异性要高，产物片段长度事宜，标记后需要纯化探针；
（2）样本提取：DNA的获得完整性很重要，防止降解；
（3）酶切和电泳：酶切时长要适合，防止酶切过度或者没切不完全；
（4）杂交：膜在杂交时要注意防止气泡出现；
 
例图：
DNA胶图                 酶切图                     显色图