分子生物学实验-载体和目的片段的酶切

一、实验目的
学习和掌握核酸的酶切操作原理；通过酶切获得可进行体外重组的载体和外源DNA。
二、实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。绝大多数限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列5'…G↓AATTC…3' 后产生两个互补的粘性末端。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。
酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。         
三、主要试剂
质粒pET30a、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA产物纯化kit、无菌水、乙醇、琼脂糖、溴酚蓝、TAE、EB、DNA marker、NaAc
四、仪器耗材
水浴锅、灭菌锅、离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。
五、酶切反应  
 
反应体系 1.     质粒        3      
                    bf          2
                    EcoRⅠ      1      (10U/μL)
                    Hind Ⅲ     1      (10U/μL)
                    H2O        13
               ---------------------------------------
                    Total       20 μL
     反应体系 2.    PCR产物   10     (50ng/μL)    （回收后的PCR产物）
                    bf          5
                    EcoRⅠ      1     (10U/μL)
                    Hind Ⅲ     1     (10U/μL)
                    H2O        33
               ----------------------------------------
                   Total       50 μL
37℃，2-4hr； 65℃，10min，终止反应。
 
质粒载体酶解液，琼脂糖胶电泳检测。切胶回收。
PCR产物酶切后不用回收，直接用于连接。可以电泳检测回收效果。
 
六、注意事项
1、DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。
2、限制性内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
3、10×bf工作浓度为1×，注意混匀。
4、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
5、酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
6、如果反应较长时间而酶切体系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反应，体积损失也会很大。采用石蜡油覆盖的方法可避免水分损失甘油浓度提高而引起的星活性。
7、混合：这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。
注意：不可振荡。