“Range+T”模式，助力Pacbio HiFi测序高质量文库构建

PacBio 独有的HiFi测序技术，可同时实现长读长和高准确性的DNA测序，在解析复杂的基因组区域、检测结构变异、揭示罕见变异和研究表观遗传学等多个领域有广泛应用。为了确保HiFi测序的产量和质量，需要将DNA文库大小控制在15-18kb范围内。因此，高精度的片段筛选是PacBio HiFi测序的关键步骤之一。Sage Science公司提供的Pippin系列全自动DNA片段回收仪--基于脉冲场电泳，可以实现上述需求，现已成为HiFi文库构建的金标准和建库必备工具之一。

为了获得更高质量的HiFi文库，Sage Science公司不断优化筛选方法，并于今年6月推出了全新的长片段回收模式“Range+T”。结合相对应的预制胶试剂盒，“Range+T”模式可有效提高9-30kb范围内片段筛选的分辨率，协助用户更精准的控制HiFi文库大小，实现片段读取长度和质量间的平衡，得到更好的基因组组装结果。

运用“Range+T”模式，只需设置回收范围起点DNA的bp值，以及回收时间（一般5-30min）即可，例如：15kb+10min。此模式的优点包括：（1）有效去除设置起点外的小片段DNA；（2）可以更精准的控制文库回收的上限；（3）可以更精准调整文库分布的宽度。近日，Sage Science公司携手亚利桑那大学基因组研究所，以植物基因组为样本，共同测试了“Range+T”模式对于增加PacBio HiFi文库平均读长的能力。由于植物基因组的复杂性更高（多倍体、重复序列、大小差异大等），因此更长的HiFi读取长度对植物基因组研究更重要。

“Range+T”片段筛选模式增加PacBio HiFi平均读长

研究成果：

1. 不同回收时间对回收得率和回收范围的影响
小麦基因组DNA经打断仪处理后，使用PippinHT回收目标片段。使用“Range+T”回收模式，不同样本的回收起点均设置为15kb，回收时间分别设置为13-30min。

图1“Range+T”模式回收的精确性

回收后检测结果显示，不同泳道回收起点的位置相同，回收的终点与设置的回收时间长短相关，设置30min的回收时间可以回收样品中更多的HWM DNA。

2. 小片段去除效果

图2“Range+T”模式小片段去除结果

如图2所示，SC28+29样品混合后（蓝色），PippinHT “Range+T”模式设置为13kb+30min进行片段回收，回收后样品有效去除回收起点以下的小片段DNA（红色），结果也在Pacbio测序结果中reads长度分布图（图2中测序结果图）得以体现。

3. 重复性测试
8个木薯样本的基因组DNA被打断成13-25kb（平均长度18kb），“Range+T”模式设置为13kb+30min进行片段回收，回收得率在33-45%之间，回收后平均片段长度在19-20kb之间，HiFi reads结果长度保持一致。

表1 “Range+T”模式重复性测试结果

图3 “Range+T”模式重复性测试Femto Pulse检测结果

4. 长片段回收能力
以3个玉米样本为例，基因组DNA打断成15-35kb片段（平均长度23-25kb）。“Range+T”模式回收起点分别设置在17kb-20kb，回收时间均为30min。结果表明DNA回收得率从17%到41%不等，可检测的最大片段长度约为50kb，提高回收起点会得到更大的片段分布，从而产生更长的平均HiFi read长度。

图4 “Range+T”模式长片段回收测试结果

5. 对测序质量影响
为了研究测序结果在产量、read质量和平均HiFi read长度之间得到更好的平衡，作者对比了PippinHT 之前软件版本9-13kb筛选模式的测序结果（图5中的蓝色符号）与最新“Range+T” 模式的测序结果（图5中的橙色符号）。使用“Range+T”模式，回收起点设置为15kb，其产生的reads平均长度在21-22kb以上，且30-40kb长度reads数量有显著提高。更重要的是，数据（图5a）表明在13kb至22kb的范围内，随着平均HiFi read长度的增加，HiFi测序数据产量几乎没有下降。由于PacBio测序中聚合酶读取长度有限，短的SMRTbell文库比长文库具有更高的QV分数，但此次实验中较长文库的最低平均QV分数仍然相当好，为28。88%的较长文库（橙色符号）的平均QV得分在30以上（图5.b-c）。
 

图5 不同设置HiFi测序产量及QV结果

为了更好地说明较长文库的质量结果，图6显示了一个平均subreads长度为22.6kb的玉米样本的reads质量分布，其中约40%的reads得分在Q30以上。

图6 玉米文库Read质量分布结果，平均长度为22.6kb

为了体现更长read对基因组组装的影响，作者组装了三个数据集。数据来自基于“Range+T”模式的PacBio-HiFi文库（表1的玉米样本）。文库的覆盖率为18×，平均HiFi read长度为20.6kb。生成了以下三个具有不同特征的数据集（表2）：

“Small”数据集代表PacBio文库制备的当前标准，而“Long”数据集结果证明了“Range+T”模式的优势。与其他数据集相比，“Long”数据集具有最低的contigs数量、最高的平均contigs长度和最高的Nx值（表2）。此外，开发“Narrow”数据集是为了研究更长read对改进组装效果的贡献。

表2 玉米M组装统计数据集

结论：
测试结果说明PippinHT最新的“Range+T”模式，可以更加灵活地选择PacBio HiFi文库的大小。“Range+T”模式具备较好的重复性，可以有效去除短片段，且使平均read长度超过当前标准。此外，新模式可以控制文库片段范围的上限，更长的文库并没有影响测序质量和产量。与较小的HiFi文库相比，更有助于大而复杂基因组的连续组装。
目前PippinHT “Range+T”模式的新版软件已经发布，Blue Pippin也将在近期发布，详细信息请联系：

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Sage Science是全球领先的研发制造Pippin系列全自动核酸电泳片段回收仪的生产厂家，拥有美国技术专利，各个型号产品可以高效完成不同长度范围的DNA片段的精准回收，广泛用于二代测序、三代测序以及多种分子生物学相关领域。
环亚生物科技有限公司作为美国Sage Science公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将Sage Science的产品线引入国内，一直为国内用户提供专业的全自动核酸片段回收系统的安装测试、应用培训，技术支持与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。环亚生物科技有限公司将一如既往的支持越来越多的Sage Science用户。