酵母质粒小量提取试剂盒的使用方法与应用

一、背景
 
酵母质粒小量提取试剂盒适用于酵母小规模高纯度质粒制备。采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lyticase特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
 
二、使用方法
 
1、从-20℃或更低的冰箱中取出血液样品，室温下静置融化。
 
2、将400μL解冻的血液转移到一个1.5mL的塑料离心管中，加入400μL溶液A，充分震荡混匀。如果是禽类血液，则少加10倍，只加40μL。
 
3、在混合液中加入400μL溶液B和200μL氯仿(自备)，振荡1分钟。由于离心管比较满，所以需要确保管底溶液转动起来，否则只是液面振动而已。
 
4、4℃12000 g离心10分钟，小心将上清转移至一新的1.5mL塑料离心管中。注意：最好不要室温离心，如果室温离心，则离心后部分样品的中间白色层可能会很厚，只能得到很少的上清。
 
5、将约0.7-0.8mL上清转移到10-15mL塑料离心管中(不要使用玻璃离心管，否则DNA会吸附到管壁上。常用的培养提质粒用的细菌的培养管即可)。
 
6、加入2.5倍上清体积的溶液C(2mL)，立即摇晃混匀。
 
7、将混合液分多次转移到离心吸附柱中，每次0.7mL左右，转移后静置2-5分钟，以使DNA与膜充分结合，然后室温12000 g离心30秒，弃收集管中的废液，然后再加入0.7mL，重复上述操作，直到全部混合液挂柱。
 
8、在离心吸附柱中加入0.7mL通用洗柱液，室温12000 g离心30秒，弃收集管中的废液。
 
9、在离心吸附柱中再加入0.3mL通用洗柱液，室温12000 g离心30秒，弃收集管中的废液。
 
10、室温12000 g离心30秒，去尽残留液体(此步骤十分重要，不要省略，否则残留的含乙醇的通用洗柱液将抑制后续的酶反应)。
 
11、将离心吸附柱置于一新的1.5mL塑料离心管中，加入50μL DNA洗脱液2.0，室温放置2分钟。如果将DNA洗脱液2.0在65℃预热后再使用，洗脱DNA的效果更佳。
 
12、室温12000 g离心30秒，离心管底部溶液即DNA溶液，可立即使用或-20℃长期保存。
 
三、应用
 
用于PRV EPO基因酵母双杂交诱饵质粒与PK-15细胞cDNA文库的构建研究：
 
构建了pGBKT7-EP0诱饵质粒和PK-15细胞cDNA文库,为更好的研究PRV EP0蛋白与宿主细胞PK-15之间的相互作用机制提供基础。
 
具体研究内容如下：第一部分：构建pGBKT7-EP0诱饵质粒采用PCR技术,扩增获得PRVEP0基因,将其克隆至酵母双杂交载体pGBKT7中,获得重组诱饵质粒pGBKT7-EP0,通过限制性内切酶EcoRI与Pst I双酶切鉴定与基因测序结果分析,表明成功构建诱饵质粒pGBKT7-EP0。将该质粒转入到Y2HGold酵母感受态细胞中,对其进行毒性检测,自激活效应检测,PCR以及Western-blot检测,结果表明诱饵质粒表达的产物对酵母细胞无毒性作用,无自激活效应,PCR和Western-blot检测结果证实诱饵质粒pGBKT7-EP0成功转入酵母细胞,并且能够表达融合蛋白BD-EP0-Myc。
 
第二部分：PK-15细胞cDNA文库构建及鉴定选取PRV的宿主细胞PK-15细胞来构建酵母双杂交cDNA文库。本试验从PK-15细胞提取总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的ds cDNA,并对其进行均一化和SfiⅠ酶切处理。将得到的dscDNA连接到三框表达载体中。将这三个重组反应产物用电转化方法转入到HST08电转化感受态细胞中,构建含有三种读码框的初级文库,该文库库容分别为3.0X 106、2.0×106和2.0×106 CFU,插入片段均在500bp以上,阳性重组率均大于93%。再将三框初级文库共同电转化至感受态细胞HST08中进行扩增,提取质粒文库。最后将质粒文库转化到Y187酵母感受态细胞,得到的cDNA酵母文库总库容量为7.5×105 CFU,基本符合酵母双杂交cDNA文库构建要求。
 
综上,成功构建了符合酵母双杂交筛选要求的诱饵质粒pGBKT7-EP0和酵母cDNA文库,为进一步研究PRV EPO蛋白与PK-15细胞蛋白之间的相互作用奠定了基础。