反向PCR基本原理及实验步骤
1概述
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。为了得到边侧序列的探针，通常采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。
2 PCR与反向PCR的区别
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段。如图1所示：
图1 PCR引物扩增方向
图2 反向PCR引物扩增方向
图3 线性DNA的环化
通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。如图4所示：
图4 反向PCR扩增
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。为了得到边侧序列的探针，通常采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。
2 PCR与反向PCR的区别
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段。如图1所示：
图1 PCR引物扩增方向
反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。如图2所示：
图2 反向PCR引物扩增方向
3 反向PCR基本原理
反向PCR（Reverse PCR）是常规聚合酶链反应技术的修改和发展，是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子。如图3所示：
反向PCR（Reverse PCR）是常规聚合酶链反应技术的修改和发展，是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子。如图3所示：
图3 线性DNA的环化
通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。如图4所示：
图4 反向PCR扩增
4 反向PCR实验步骤
（1）限制性内切酶消化
① 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。
② 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点（如EcoR I、BamH I、Hind III和Pst I），并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：
（1）限制性内切酶消化
① 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。
② 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点（如EcoR I、BamH I、Hind III和Pst I），并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：
37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。
（2）回收DNA
① 将酶切产物转到1.5 mL离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 μL；
② 加入等体积的酚和氯-仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min；
③ 12,000 rpm离心1 min；
④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯-仿，涡旋混匀，室温静置1 min；
⑤ 12,000 rpm离心2 min；
⑥ 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min；
⑦ 4℃ 12,000 rpm离心10~15 min；
⑧ 弃上清，尽量除去管壁上的液体；
⑨ 加入1 mL -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。12,000 rpm离心5 min；
⑩ 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 μL ddH2O溶解。-20℃保存。
(3) 连接
① 连接体系如下：
（2）回收DNA
① 将酶切产物转到1.5 mL离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 μL；
② 加入等体积的酚和氯-仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min；
③ 12,000 rpm离心1 min；
④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯-仿，涡旋混匀，室温静置1 min；
⑤ 12,000 rpm离心2 min；
⑥ 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min；
⑦ 4℃ 12,000 rpm离心10~15 min；
⑧ 弃上清，尽量除去管壁上的液体；
⑨ 加入1 mL -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。12,000 rpm离心5 min；
⑩ 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 μL ddH2O溶解。-20℃保存。
(3) 连接
① 连接体系如下：
12-14℃，过夜连接。
注：连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。
② 连接完成后，65℃水浴10 min灭活。按上述（2）抽提回收，溶解于40 μL ddH2O中。然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
5反向PCR技术的不足
注：连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。
② 连接完成后，65℃水浴10 min灭活。按上述（2）抽提回收，溶解于40 μL ddH2O中。然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
5反向PCR技术的不足
- 需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
- 大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
- 反向PCR技术适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究，可用于克隆启动子。
- 反向PCR技术有着自己独特的特点，虽然有不足之处，但它在各学科和各领域都有着重要的作用。随着PCR技术和分子生物学的发展，它在各学科和各领域的作用将会越来越重要，应用也将会更加普遍。
