多重免疫荧光/多重免疫组化及肿瘤微环境系列3：
自配自研mIHC/mIF试剂
蛋白质水平的多重免疫组织化学（mIHC）和多重免疫荧光（mIF）能分析、量化肿瘤中免疫细胞亚群、其功能状态及其在肿瘤微环境中的空间排列等，是目前检测肿瘤微环境免疫状态的核心技术。在准备开展mIHC/mIHC时样本数量、多通道成像、预算和是否有图像分析能力是重点考虑的事情。由于所有多重免疫组化（mIHC/mIF）都有创建和验证多种抗体组合的过程，我们的建议基本上都是关于创建一个由10-60个抗体组成的多重免疫组化检测模块的。南京泰立瑞的mIHC/mIF系列的文章的主要受众是基础或转化医疗研发人员，或准备开展mIHC/mIF常规检测前建立方法学的临床病理、检验人员。
本篇是mIHC/mIF系列的第三篇，因为mIHC/mIF业务的新颖性，开展此业务势必会涉及到自配自研mIHC/mIF试剂，本篇主要讨论如何自配自研相关mIHC/mIF试剂。
自配自研试剂
在从事基础医学和转化医疗的实验室，除购买商业试剂外，经常需要自研自配试剂，创建一个新的mIHC/mIF检测也不例外。而且市面上也已经许多商业成熟的基础试剂盒供我们根据我们的具体情况自研抗体试剂，主要是抗体标记的欧联反应。
许多低重（1-4种生物标志物，相对于多重5-60种）IHC和IF方法通过一抗、二抗（间接标记、间接检测）检测来实现信号放大。这些间接标记方法虽然方便，但由于一抗仅仅来源于有限的数个物种（大鼠、小鼠、兔、山羊），因此，通常使用直接修饰需要修饰一抗或标记一抗（图1）和表S1）。最终，试剂制备策略取决于成本、原料可及性、技术能力、规模和预期实验设计。目前多种抗体欧联方法用于抗体标记，各有优缺点和可调变量，包括但不限于：交联剂化学、交联剂浓度、pH值、反应缓冲液和纯化策略等。标记程度和欧联纯度/均一性等因素可能因方法和可调变量而异。通常，欧联反应多以抗体的赖氨酸、半胱氨酸或聚糖残基为目标（图4），但也有以蛋白质N-末端、特定赖氨酸或抗体的Fc区域为靶向的。此外，也有用非共价方法如一抗与二抗的聚合试剂（例如，一抗与二抗的Fab区复合物）、及纳米体或蛋白质A/G）。
抗体标记的欧联反应
因为基于赖氨酸的欧联反应具有快速、经济、可控且可扩展的优点，其常常用于常规荧光标记和寡核苷酸barcode标记。一个IgG分子有超过40个暴露于表面的赖氨酸，通过调整与这些赖氨酸的结合数目可以调整抗体与标记物的比率。这些标记不是位点特异性的，可能导致与非赖氨酸氨基酸的异质结合和交叉反应。如果欧联的赖氨酸位于抗体活性结合部位，则标记可降低抗原抗体的结合活性。这些都可能使抗体的标准化和验证更加困难，尽管最近出现了位点特异性赖氨酸欧联技术，但也只解决了其中部分问题。
最近基于半胱氨酸的耦合物快速、经济、可扩展，基于半胱氨酸的结合已被证明能产生更均匀和可重复的结果，但一个IgG分子通常只有12个可用的半胱氨酸位点，标记程度低，半胱氨酸还可能导致标记物（荧光染料）彼此欧联，这往往导致荧光猝灭而减少荧光。目前基于半胱氨酸的耦合主要用于金属标记和寡核苷酸barcode。。此外，抗体在与亚甲酰亚胺、荧光团/螯合剂或交联剂结合之前，必须用二硫苏糖醇或2-羧乙基膦（tris）轻微还原，这可能会影响抗体结构的完整性和抗体亲和力。
通常，基于聚糖的方法常常用于小规模欧联或当其他方案失败时或当标记寡核苷酸barcode时。平均而言，IgG在重链上包含两个聚糖位点。因此，基于聚糖的结合物具有位点特异性，是需要较少的抗体-标记比率优化时优先使用的方法，此方法也更具重现性，并且避免因为结合位点导致的抗体失活。不幸的是，该方案通常耗时较长，需要酶促反应，成本更高且难以扩展。另外，通常的商用抗体制剂可能无法直接用此方法进行欧联反应，因为它们通常含有叠氮化钠、牛血清白蛋白（BSA）、甘油和/或冷冻保护剂。使用此方法时，为了促进欧联反应，我们建议购买简单缓冲液（如PBS）的抗体或进行亲和纯化。此外，储存应保存在PBS或硼酸盐缓冲盐水中。由于每次欧联反应都会导致抗体部分损耗，我们建议从50-100µg抗体纯化开始。各种欧联反应的程序和方法千差万别，我们在这里直观地总结了常见的方法（图一）。
图一：抗体标记即抗体与各种标记进行欧联的过程。
自配自研抗体试剂的生成和验证往往是开发基于抗体的多重mIHC/mIF的主要瓶颈。与单IHC/IF相比，与多重mIHC /mIF实验相关的抗体选择、抗体组合和抗体验证均增加了试验成本和工作量。自己欧联还引入了额外的批次间变化，特别是用于学术研究的小规模制备。虽然商业定制欧联服务和现成的欧联试剂盒可以更容易地标记抗体从而为定制个性化的mIHC抗体组合模块，但如果有更多的商业产品选择，有更多的与标准荧光染料、金属离子和寡核苷酸barcode欧联的商业一抗将促进mIHC/mIF技术的广泛应用。此外，抗体性能经常受与其欧联的金属离子、荧光或寡核苷酸barcode的影响。因此，针对低丰度表达蛋白质的抗体应选择不和自荧光重叠的明亮荧光欧联。类似地，优先使用那些之前已在组织染色中被验证的金属标记和寡核苷酸barcode。抗体欧联后，应通过与未欧联的同一抗体比较以确认最终抗体及标记的性能（图一）。标记后的抗体还可能需要改变组织封闭和抗体孵育条件以获得最佳性能。
目前基于荧光标记的多重荧光组织免疫mIF/mIHC是探测肿瘤微环境应用最广泛的技术，TLR专注于mIF/mIHC的相关技术，致力于将免疫染色（mIF/mIHC）、荧光图像采集和分析的自动化和智能化，研发用于mIF/mIHC的全自动免疫组化染色机（TR-Stainer）和荧光全切片扫描仪，其中TR-sWSI-5F荧光扫描仪是一款轻量入门级产品，具备快速5色扫描功能（蓝色DAPI、绿色FITC、黄色TRITC、红色Cy5、近红外Cy7），满足目前免疫荧光组化的绝大多数临床需求。而TR-sWSI-MF 的多光谱荧光扫描仪可以将多达15种颜色和自体荧光彼此得到很好的分离，从而使用户信心百倍地专注于量化真正发生的生物学相互作用，能够在整个切片上同时观察和测量组织的细胞，包括多种细胞表型。
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多重免疫荧光染色技术（mIF）
