InnoScan 710-IR扫描仪在节约反相蛋白微阵列RPPA检测成本的应用
摘要
反相蛋白微阵列 (RPPA) ，已被证明是对大型患者队列进行生物标志物评估的有用工具。使用经过验证的抗体，可在单个实验跟踪细胞命运的生物标志物。这项技术的挑战之一是动态范围，因为在同一队列中，生物标志物的表达水平可能从飞摩尔 (fM) 到微摩尔 (µM) 浓度不等。已经开发了几种技术来跟踪生物标志物的表达。荧光检测已被证明较比色和化学发光检测更灵敏。然而，所有这些技术都必须进行优化以克服动态范围有限的挑战。一种解决方案是对样品进行连续稀释。然而，这增加了 RPPA 的复杂性，并使数据解析非常繁琐。此外，连续稀释会增加 RPPA 成本，因为每个实验需要几张芯片。这里，我们将描述从比色检测到荧光检测的方法转变过程中，如何使用 InnoScan 710-IR 扫描仪动态范围扩展 (XDR) 功能，大幅降低 RPPA 成本。
正文
蛋白质被认为是细胞对内源性或外源性刺激反应的主要效应分子。当刺激发生时，细胞通过调节“关键”蛋白质的表达来改变细胞功能。这些“关键”蛋白质被称为生物标志物。反相蛋白质微阵列 (RPPA) 旨在跟踪数百或数千个样本中的生物标志物。在 RPPA 技术中，细胞裂解物被点在载玻片上，并通过使用经过验证的抗体，以非常简单的方式检测生物标志物的表达（图 1）。 RPPA其实就是小型化斑点印记（dot blots）实验。
为了在免疫检测中对蛋白质成像，使用标记的二抗。二抗可以与荧光蛋白（荧光团）或碱性磷酸酶 (AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP) 等酶结合。在酶检测中，当添加酶底物时，有色沉淀物沉积在载玻片上（比色检测）或形成化学发光产物，其光信号被适当的检测器捕获（化学发光检测）。在荧光检测中，在免疫检测过程中直接使用标记有荧光团的一抗或二抗。在这种情况下，可以使用适当的扫描仪（例如Innopsys 的 InnoScan 扫描仪），进行荧光信号检测。与比色法和化学发光检测相比，荧光检测已被证明具有多项优势；主要优点是灵敏度和动态范围。
图 1.RPPA 工作流程。橙色标记了影响耗材成本的关键步骤。连续稀释样品会增加成本；带或不带 XDR 检测的荧光检测将 RPPA 总体成本降低了至少 30%。
图 2. 动态范围扩展 (XDR)。为了解决样品间蛋白质表达水平差异大的问题，Innopsys 开发了一种扫描模式，可以在保持微弱信号的同时避信号饱和。 A) 以手动模式扫描的 RPPA 芯片；图像是动态范围为 104 的 16 位 TIF 图像。 B) 使用 XDR 扫描模式扫描的同一芯片；图像是动态范围高于 106 对数的 20 位 TIF 图像
荧光检测的动态范围是化学发光检测的 10 倍，因此检测限内的线性更好，使信号量化更准确。RPPA实验 的最大挑战之一是检测蛋白表达变化所需的动态范围。一些生物标志物的动态范围可达 106，这意味着它们可以在某些样品中以飞摩尔 (fM) 浓度存在，而在其他样品中以微摩尔 (µM) 浓度存在。106 动态范围超出了具备103 或 104 动态范围检测设备的检测范围。为了克服这个问题，应该对每个样品进行连续稀释以扩大检测动态范围，但必须使用信号放大系统来检测弱表达的生物标志物。此过程使数据分析和解析更加复杂，因为每个样品都需要五个或更多稀释梯度才能包含在分析中。此外，连续稀释样品会增加测定成本，因为实验所需的载玻片数量会增加一倍或三倍，从而增加耗材成本。 Innopsys 通过在其扫描仪型号中加入动态范围扩展 (XDR) 模式解决了这个问题。使用 XDR 模式，信号检测动态范围从 104扩展到 106 以上，因此能够在单次扫描中检测低信号和高信号（图 2）。XDR 模式已被证明可以保持不同样本之间的数据分布不变，这在比较来自不同样本的信号时必不可少。 借助 XDR 功能，不再需要连续稀释，从而减少了每次实验的载玻片数量，从而降低最终成本。
图 3 描述了一个 RPPA 实验室以每年生产约 300 张芯片的成本估算。在此示例中，参考实验室估计，使用荧光检测可以通过进行相同的样品系列稀释，为相同数量的载玻片节省大约 30% 的耗材成本。通过 InnoScan 710-IR 扫描仪荧光检测和 XDR 扫描模式，载玻片数量减少 3 倍，耗材成本降低90%。
图 3. 年耗材成本估算。我们的参考实验室估算了 300 张载玻片的年耗材成本，并比较了不同的检测方法。成本以美元表示，并根据 2014 年耗材目录价。通过使用近红外 (NIR) 荧光检测代替比色检测，可将耗材成本降低 30%。通过使用 NIR 荧光检测结合 XDR 扫描模式，载玻片数量可以减少 3倍，与比色检测相比，成本节省高达 90%。
总之，荧光检测已被证明是一种有用的检测工具，具有以下几个优点：(i) 多重检测：使用不同颜色的荧光团同时检测同一张载玻片上的两种或多种目标蛋白。(ii)灵敏度：近红外检测几乎消除了背景信号，因此与可见荧光检测相比，信噪比提高了 4 倍。它还可以在没有信号放大系统的情况下检测弱表达的蛋白质。 (iii) 动态范围：通过使用适当的检测器（例如光电倍增管 PMT），可以提高灵敏度和动态范围。在这里，我们已经证明，通过使用 InnoScan 710-IR 的 XDR 扫描模式，RPPA 实验成本显著降低，从而使 RPPA 适合对大型队列中的生物标志物进行精确分析。
反相蛋白微阵列 (RPPA) ，已被证明是对大型患者队列进行生物标志物评估的有用工具。使用经过验证的抗体，可在单个实验跟踪细胞命运的生物标志物。这项技术的挑战之一是动态范围，因为在同一队列中，生物标志物的表达水平可能从飞摩尔 (fM) 到微摩尔 (µM) 浓度不等。已经开发了几种技术来跟踪生物标志物的表达。荧光检测已被证明较比色和化学发光检测更灵敏。然而，所有这些技术都必须进行优化以克服动态范围有限的挑战。一种解决方案是对样品进行连续稀释。然而，这增加了 RPPA 的复杂性，并使数据解析非常繁琐。此外，连续稀释会增加 RPPA 成本，因为每个实验需要几张芯片。这里，我们将描述从比色检测到荧光检测的方法转变过程中，如何使用 InnoScan 710-IR 扫描仪动态范围扩展 (XDR) 功能，大幅降低 RPPA 成本。
正文
蛋白质被认为是细胞对内源性或外源性刺激反应的主要效应分子。当刺激发生时，细胞通过调节“关键”蛋白质的表达来改变细胞功能。这些“关键”蛋白质被称为生物标志物。反相蛋白质微阵列 (RPPA) 旨在跟踪数百或数千个样本中的生物标志物。在 RPPA 技术中，细胞裂解物被点在载玻片上，并通过使用经过验证的抗体，以非常简单的方式检测生物标志物的表达（图 1）。 RPPA其实就是小型化斑点印记（dot blots）实验。
为了在免疫检测中对蛋白质成像，使用标记的二抗。二抗可以与荧光蛋白（荧光团）或碱性磷酸酶 (AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP) 等酶结合。在酶检测中，当添加酶底物时，有色沉淀物沉积在载玻片上（比色检测）或形成化学发光产物，其光信号被适当的检测器捕获（化学发光检测）。在荧光检测中，在免疫检测过程中直接使用标记有荧光团的一抗或二抗。在这种情况下，可以使用适当的扫描仪（例如Innopsys 的 InnoScan 扫描仪），进行荧光信号检测。与比色法和化学发光检测相比，荧光检测已被证明具有多项优势；主要优点是灵敏度和动态范围。
图 1.RPPA 工作流程。橙色标记了影响耗材成本的关键步骤。连续稀释样品会增加成本；带或不带 XDR 检测的荧光检测将 RPPA 总体成本降低了至少 30%。
图 2. 动态范围扩展 (XDR)。为了解决样品间蛋白质表达水平差异大的问题，Innopsys 开发了一种扫描模式，可以在保持微弱信号的同时避信号饱和。 A) 以手动模式扫描的 RPPA 芯片；图像是动态范围为 104 的 16 位 TIF 图像。 B) 使用 XDR 扫描模式扫描的同一芯片；图像是动态范围高于 106 对数的 20 位 TIF 图像
荧光检测的动态范围是化学发光检测的 10 倍，因此检测限内的线性更好，使信号量化更准确。RPPA实验 的最大挑战之一是检测蛋白表达变化所需的动态范围。一些生物标志物的动态范围可达 106，这意味着它们可以在某些样品中以飞摩尔 (fM) 浓度存在，而在其他样品中以微摩尔 (µM) 浓度存在。106 动态范围超出了具备103 或 104 动态范围检测设备的检测范围。为了克服这个问题，应该对每个样品进行连续稀释以扩大检测动态范围，但必须使用信号放大系统来检测弱表达的生物标志物。此过程使数据分析和解析更加复杂，因为每个样品都需要五个或更多稀释梯度才能包含在分析中。此外，连续稀释样品会增加测定成本，因为实验所需的载玻片数量会增加一倍或三倍，从而增加耗材成本。 Innopsys 通过在其扫描仪型号中加入动态范围扩展 (XDR) 模式解决了这个问题。使用 XDR 模式，信号检测动态范围从 104扩展到 106 以上，因此能够在单次扫描中检测低信号和高信号（图 2）。XDR 模式已被证明可以保持不同样本之间的数据分布不变，这在比较来自不同样本的信号时必不可少。 借助 XDR 功能，不再需要连续稀释，从而减少了每次实验的载玻片数量，从而降低最终成本。
图 3 描述了一个 RPPA 实验室以每年生产约 300 张芯片的成本估算。在此示例中，参考实验室估计，使用荧光检测可以通过进行相同的样品系列稀释，为相同数量的载玻片节省大约 30% 的耗材成本。通过 InnoScan 710-IR 扫描仪荧光检测和 XDR 扫描模式，载玻片数量减少 3 倍，耗材成本降低90%。
图 3. 年耗材成本估算。我们的参考实验室估算了 300 张载玻片的年耗材成本，并比较了不同的检测方法。成本以美元表示，并根据 2014 年耗材目录价。通过使用近红外 (NIR) 荧光检测代替比色检测，可将耗材成本降低 30%。通过使用 NIR 荧光检测结合 XDR 扫描模式，载玻片数量可以减少 3倍，与比色检测相比，成本节省高达 90%。
总之，荧光检测已被证明是一种有用的检测工具，具有以下几个优点：(i) 多重检测：使用不同颜色的荧光团同时检测同一张载玻片上的两种或多种目标蛋白。(ii)灵敏度：近红外检测几乎消除了背景信号，因此与可见荧光检测相比，信噪比提高了 4 倍。它还可以在没有信号放大系统的情况下检测弱表达的蛋白质。 (iii) 动态范围：通过使用适当的检测器（例如光电倍增管 PMT），可以提高灵敏度和动态范围。在这里，我们已经证明，通过使用 InnoScan 710-IR 的 XDR 扫描模式，RPPA 实验成本显著降低，从而使 RPPA 适合对大型队列中的生物标志物进行精确分析。
