大肠杆菌蛋白表达原理方法和种类

大肠杆菌蛋白表达原理
 
1. 表达载体
 
小型环状DNA可以自我复制。完整的质粒载体必须具有复制起点，启动子，插入的目的基因，筛选标记和终止子。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体，前者是在目标蛋白的N端/C端添加特殊的序列，从而促进蛋白的可溶性和正确折叠，方便目的蛋白的快速亲和纯化，或者目标蛋白的表达定位。His和GST-是常使用的融合标签。
 
2. 表达宿主菌
 
表达蛋白质的生物即为大肠杆菌。宿主细菌的选择主要基于宿主细菌的特征和靶蛋白的特征。例如，靶蛋白需要形成二硫键。可以选择Origami 2系列，Origami可以显着增加在细胞质中形成二硫键的可能性，并提高蛋白质的溶解度和活性。
 
大肠杆菌表达系统种类
 
1. T7大肠杆菌表达
 
T7大肠杆菌表达表达目的基因的水平较高。但是如果目的基因对大肠杆菌有毒性，则会影响细胞的生长。T7大肠杆菌表达是用T7启动子和T7 噬箘体转录体系的元件构建的表达系统。T7 RNA聚合酶是高活性RNA聚合酶，mRNA的合成速度是大肠杆菌中RNA聚合酶的五倍，并且某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以被转录，因此T7RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下，大肠杆菌本身的转录系统竞争不过T7噬箘体转录体系，最终受 T7噬箘体启动子控制蛋白转录。
 
2. Lac和Tac大肠杆菌表达系统
 
Lac和Tac大肠杆菌表达系统是一种基于大肠杆菌紫胶操纵子调控机制设计和构建的表达系统。紫胶操纵子具有多顺反子结构。在没有诱导剂的情况下，负调控因子lacI基因产物与启动子下游的操纵基因紧密结合，并开始组织转录。在诱导物IPTG的存在下，与阻遏物结合后，与操纵子结合的能力降低并解离，从而激活了lac操纵子的转录。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能够严格调节Lac和Tac表达系统，将能够产生过量lacI阻遏蛋白的lacI基因的突变型lacIq应用于表达系统。然而，当使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍然观察到更高水平的背景转录，并且将lacIq基因插入表达载体中以确保更多的lacI阻遏蛋白产生。
 
目前，许多商业表达载体是在Lac和Tac表达系统的基础上改进和发展的。 Lac和Tac表达系统使用IPTG诱导转录，但是由于IPTG本身的毒性，从安全角度考虑，它不适合用于医学目的表达和制备重组蛋白。一些国家还规范了供人类使用的重组蛋白的生产。 IPTG无法用于生产过程，因此认为阻遏蛋白lacI的温度敏感突变体lacI（ts）可以应用于Lac和Tac表达系统。这些突变基因可以插入表达载体或整合到染色体中以实现lac。tac启动子的转录受温度严格调节，在较低温度（30°C）下受到抑制，而在较高温度（42°C）下开放。乳糖也可以代替IPTG诱导剂使用，但是其效率受多种因素的影响，并且受限制，因此乳糖导的有效剂量比IPTG高得多，乳糖本身可以被大肠杆菌作为碳源代谢。乳糖的存在还可以引起细菌的生理和生长特性的变化。
 
3. PL和PR大肠杆菌表达系统
 
以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的系统称为PL和PR大肠杆菌表达系统。启动子PL、PR具有很强的启动转录能力，利用它们来构建表达载体在大肠杆菌表达系统发展初期就已被提出来并加以研究。这种表达系统基于温度敏感突变体cl857的基因产物来调控PL、PR启动子的转录，该基因产物在较低温度（30℃）时以活性形式存在，在较高温度（42℃）时失活。这种表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定，这是因为菌体中没有cl基因产物，PL或PR启动子的高强度直接转录所导致。解决这个问题的办法之一是用溶源化λ噬箘体的大肠杆菌作为PL和PR启动子表达载体的宿主菌；办法之二是把cI857ts基因组装在表达载体上，这样就可以有更大的宿主菌选择范围。
 
由于PL和PR表达系统在诱导时不需要加入化学诱导剂，且成本低廉，因此起初几个在大肠杆菌系统中制备的药用重组蛋白质都采用这种表达系统。但是，它也有其本身的缺陷，首先是在热刺激过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中包括蛋白水解酶，因此有可能降解表达的重组蛋白。其次是大体积发酵培养菌体时，把培养温度从30℃提高到42℃比较缓慢，这种的升温方式可能影响诱导效果，影响重组蛋白的表达量。
 
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