双萤光素酶报告基因检测原理及应用

报告基因是一类使表达产物易于被检测的基因，其作用原理是将报告基因的编码序列及其表达调控序列与目的基因融合形成嵌合基因，在调控序列的作用下进行表达，通过对报告基因表达产物的检测来评价目的基因的表达状况。

常见的报告基因包括萤光素酶（Luciferase）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、分泌性人胎盘碱性磷酸酶（SEAP）和绿色荧光蛋白（GFP）等。
 

萤光素酶（Luciferase）是一类在生物体内能够催化荧光素或脂肪醛氧化发光的酶，从自然界能够发光的生物体内分离获得。由于特异性强、灵敏度高、内源性低、检测不受细胞内其他物质的影响等优点，萤光素酶被作为报告基因（标记蛋白）而被广泛应用。
 

双萤光素酶报告基因检测系统在单萤光素酶报告基因的基础上引入了“内参对照”报告基因，这样可以在最大程度上减小细胞数目、细胞生长状态和转染效率等外在因素对于实验的影响，使得实验结果更为可信。

应用

应用1：順式作用原件研究

鸡骨形态生成蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因不同启动子截短体报告载体的双萤光报告结果显示，BMP15基因启动子-153-1 bp 为核心区域。

应用2：细胞信号通路研究

图2 检测不同浓度的HLY78系列衍生物对Wnt信号通路报告基因TOPflash的萤光素酶活性影响
 

通过检测不同浓度的HLY78系列衍生物对Wnt信号通路报告基因TOPflash的萤光素酶活性影响，筛选出HLY78和HLY119对Wnt信号通路有抑制作用。

应用3：反式作用因子研究

图3 在-562- -200位点是Runx1 发挥对Mrgprd 基因的转录激活的关键位点

图4 Runx1 通过+70 ～ +143位点序列促进Mrgprd基因转录
 

Runx1（转录因子）对Mrgprd基因的转录调控机制可能有多种，并非只是通过结合在Mrgprd基因上游的结合位点来直接调控其转录。

应用4：miRNA靶点研究

图5 miRNA靶点研究案例
 

miR-1269b过表达可明显降低293T细胞中METTL3-WT的萤光素酶活性，但对METTL3-MUT的活性没有显著影响，表明miR-1269b可靶向METTL3 3’UTR，负调控GC细胞中METTL3的表达。

注：应用数据均来自文献

参考文献

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