抗体FC验证应用实验细胞染色步骤详解

一、细胞表面染色操作流程

①细胞计数

细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清。

②制备单细胞悬液

将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液。

③（可选）阻断Fc受体

室温孵育10-20min。

④一抗孵育

每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min。

⑤洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑥二抗孵育

对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤8。

⑦ 洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑧重悬细胞

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
 

 

二、细胞胞内染色操作流程

①细胞计数

将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清。

②制备单细胞悬液

将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液，400g离心5min去上清。

③固定

每孔加入100μl细胞固定剂重悬细胞，2-8°孵育20min。

④洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑤洗涤

每孔加入100μl细胞通透剂重悬细胞，室温孵育20min。

⑥洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑦ (可选）阻断Fc受体：

10-20min。

⑧一抗孵育

每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min。

⑨洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑩二抗孵育

对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤11。

⑪洗涤

400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

⑫上机分析

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
 

 

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