应用方案 ┃ 饲料中总汞、总磷的测定 原子荧光光度法 分光光度法
原理
动物源性食品是食品行业的中的重要组成，在其生产过程中，过量的有毒有害物质，特别是重金属元素通过所饲养的动物排泄到土壤或水域中，对人类的生存环境构成威胁。为维护我国动物源性食品安全，农业农村部下达第194号文件，决定加强饲料商品管理。其中重金属元素汞毒性强，是饲料样品中重要的检测指标。
试样经酸加热消解后。在酸性介质中,试样中汞被硼氢化钾(KBH.)或硼氢化钠(NaBH,)还原成原子态汞,由载气(氩气带人原子化器中，在特制汞空心阴极灯照射下，基态汞原子被激发至高能态,在去活化回到基态时,发射出特征波长的黄光,其荧光强度与汞含量成正比，与标准系列比较定量。
标准依据GB/T 13081- -2022
仪器及试剂
AFS-680原子荧光光度计。
汞空心阴极灯；
微波消解炉；
实验室用样品粉碎机或研钵。
硝酸( 优级纯)。
30%过氧化氢。
硫酸(优级纯)。
混合酸液硫酸 +硝酸+水(1+1+8):量取10 mL硝酸(4:2.1)和10 mL硫酸(4.2.3),缓缓.
倒人80mL水中,冷却后小心混匀。
硝酸溶液:量取50 mL硝酸,缓缓倒入450 mL水中,混匀。
氢氧化钾溶液(5 g/L):称取5.0g氢氧化钾,溶于水中,稀释至1 000 mL,混匀。
硼氢化钾溶液(5 g/L):称取5.0 g硼氢化钾,溶于5.0 g/L的氢氧化钾溶液中,并稀释至
1000mL,混匀,现用现配。
汞标准储备溶液:按GB/T602--2002中规定进行配制,或者选用国家标准物质一汞标准溶
液(GBW 08617),此溶液每毫升相当于1000ug汞。
汞标准工作溶液:吸取汞标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中,用硝酸溶液(4.2.5)稀释至刻度,混匀,此溶液浓度为10 ug/mL.再分别吸取10 ug/mL汞标准溶液1 mL和5 mL于两个100 mL容量瓶中，用硝酸溶液(4.2.5)稀释于刻度,混匀,溶液浓度分别为100 ng/mL和500 ng/mL,分别用于测定低浓度试样和高浓度试样,制作标准曲线,现用现配。
分析步骤
微波消解法
称取0.20g~1.0g试样,精确到0.0001 g,置于消解罐中加人2 mL~10 mL硝酸，2mL~4mL过氧化氢,盖好安全阀后,将消解罐放人微波炉消解系统中，根据不同种类的试样设置微波炉消解系统的最佳分析条件(见表1和表2),至消解完全,冷却后用硝酸溶液洗涤消解罐并定容至50 mL容量瓶中(低含量试样可定容至25 mL容量瓶)混匀待测。同时做试剂空白试验。
标准系列配制
低浓度标准系列:分别吸取100 ng/mL汞标准使用液0. 50 mL、1. 00 mL、2. 00 mL、4. 00 mL、5. 00 mL于50 mL容量瓶中,用硝酸溶液稀释至刻度,混匀。各自相当于汞浓度1.0 ng/mL.2.0 ng/mL.4. 0 ng/mL.8. 0 ng/mL.10. 0 ng/mL.此标准系列适用于-般试样测定。
高浓度标准系列:分别吸取500 ng/mL汞标准使用液0. 50 mL、1. 00 mL.2. 00 mL、3. 00 mL.4.00 mL于50 mL容量瓶中,用硝酸溶液稀释至刻度,混匀。各自相当于汞浓度5. 0 ng/ mL、10.0 ng/mL.20. 0 ng/mL.30. 0 ng/ mL.40.0 ng/mL.此标准系列适用于鱼粉及含汞量偏高的试样测定。
仪器参考条件
光电倍增管负高压:260V;汞空心阴极灯电流:30mA;原子化器:温度300C,高度8.0mm;氩气
流速:载气500mL/min,屏蔽气1000mL/min;测量方式:标准曲线法;读数方式:峰面积;读数延迟时间:1.0 s;读数时间:10.0 s;硼氢化钾溶液加液时间:8.0 s;标准或样液加液体积:2 mL。仪器稳定后，测标准系列，至标准曲线的相关系数r>0.999后测试样。
浓度测定方式:设定好仪 器最佳条件,逐步将炉温升至所需温度后,稳定10 min~20 min后开始测量。连续用硝酸溶液进样,待读数稳定之后,转入标准系列测量,绘制标准曲线。转入试样测量,先用硝酸溶液进样,使读数基本回零,再分别测定试样空白和试样消化液,每测不同的试样前都应清洗进样器。
仪器自动计算结果方式:设定好仪器最佳条件,在试样参数画面输入以下参数:试样质量(g),稀释体积(mL),并选择结果的浓度单位,逐步将炉温升至所需温度,稳定后测量。连续用硝酸溶液
进样,待读数稳定之后,转人标准系列测量,绘制标准曲线。在转入试样测定之前,再进人空白
值测量状态,用试样空白消化液进样,让仪器取其均值作为扣底的空白值。随后即可依法测定试样。测定完毕后,选择“打印报告”即可将测定结果自动打印。
计算
式中:
ω试样中汞的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); .
C-试样消化液中汞的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL);
C0-试剂空白液中汞的含量,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V--试样消化液总体积,单位为毫升(mL);
m-试样质量,单位为克(g)。
测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数值；
精密度
在重复性条件下，获得的两次独立测量结果与算术平均值的绝对差值与该算术平均值的比值及相对偏差r应符合下表要求；
| 测定结果/(mg/kg) | 相对偏差（r）% |
| ≤0.020 | ≤100 |
| 0.020-0.100 | ≤50 |
| ≥0.100 | ≤20 |
第二部分：饲料中总磷的测定 分光光度法
1.范围
本标准规定了用钼黄分光光度法测定饲料中总磷量的方法。
本标准适用于饲料原料(除磷酸盐外)及饲料产品中磷的测定。
2、引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T6437-2002
3.原理
将试样中的有机物破坏，使磷元素游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色的 [(NH4)3P04NH4VO3 ·16MoO3〕络合物，在波长400 nm下进行比色测定。
4.试剂
实验室用水应符合 GB/T 6682中三级水的规格，本标准中所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。
4.1， 盐酸溶液:1+1
4.2 硝酸。
4. 3 高氯酸。
4.4 钒钼酸铵显色剂:称取偏钒酸铵 1. 25 g，加水 200 mL加热溶解，冷却后再加入 250 ml硝酸 (4.3)，另称取钼酸铵25 g，加水400 mL加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容至 1 000 ml，避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。
4.5 磷标准液:将磷酸二氢钾在 105摄氏度干燥 1h，在干操器中冷却后称取0.2195g溶解于水，定量转入1 000 ml容量瓶中，加硝酸 3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，即为50 ug/mL的磷标准液。
5、仪器和设备
5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。
5.2 分样筛:孔径0.42 mm(40目)。
5. 3 分析天平:感量0. 0001 g,
5.4 V-1500型分光光度计:可在 400 nm下测定吸光度。
5. 5 比色皿:1 cm
5.6 高温炉:可控温度在(55。士20)'C.
5.7 瓷坩埚:50 ml,.
5.8 容量瓶:50.100,1000 ml
5.9 移液管:1.0,2. 0,5.0,10.0 ml.
5.10 三角瓶:250 ml。
5.11 凯氏烧瓶:125,250 ml。
5.12 可调温电炉:1000W
6.试样制备
取有代表性试样2 kg，用四分法将试样缩分至250 g，粉碎过0.42 mm孔筛，装入样品瓶中，密封保存备用。
7、测定步骤
7.1 试样的分解
7.1.1 干法{不适用于含磷酸氢钙[Ca(H2PO4)2]的饲料} 称取试样 2 g-5 g(精确至。.0002g)于柑涡中，在电炉上小心炭化，再放人高温炉，在 550 C灼烧 3 h(或测粗灰分后继续进行)，取出冷却，加人 10 mL盐酸(4-1)和硝酸(4.2)数滴，小心煮沸约10 min, 冷却后转入 100 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
7.1.2 湿法
称取试样 0.5 g-5 g(精确至0. 000 2 g)于凯氏烧瓶中，加人硝酸(4.2)30 mL，小心加热煮沸至黄 烟逸尽，稍冷，加人高氯酸(4.3)10 m工，继续加热至高氯酸冒白烟(不得蒸干)，溶液基本无色，冷却，加 水 30 ml，加热煮沸，冷却后，用水转入 100 mL容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
7.1.3 盐酸溶解法(适用于微量元素预混料) 称取试样。.2g^1 g(精确0.0002g)于100 mL烧杯中，缓缓加入盐酸(4. 1)10 mL，使其全部溶解，冷却后转入 100 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
7.2 工作曲线的绘制 准确移取磷标准液(4. 5)0.0,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0 ml于 50 mL容量瓶中，各加钒钼氨酸显色剂(4. 4) 10 ml ，用水稀释到刻度，摇匀，常温下放置 10 min以上，以0.0 mL溶液为参比，用 1 cm比色 皿，在 400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线
7.3 试样的测定 准确移取试样分解液 1. 0 mL-10. 0 mL(含磷量50ug-750 ug)于50 mL容量瓶中，加人钒钥酸 钱显色剂(4.4)10 mL，用水稀释到刻度，摇匀，常温下放置 10 min以上，用 1 cm 比色皿在 400 nm波长下测定试样分解液的吸光度 ，在工作曲线上查得试样分解液的磷含量。
8 测定结果的计算及表述
8.1 结果计算
测定结果按式(1)计算：
x一 以质量分数表示的磷含量%;
m1 一 由工作曲线查得试样分解液磷含量ug;
V- 试样分解液的总体积ML;
m一 试样的质量g;
V1 一试样测定时移取试样分解液体积mL
8.2 结果表示
每个试样称取两个平行样进行测定，以其算术平均值为测定结果，所得到的结果应表示至小数点后两位。
9 允许差
含磷量 0.5%以下.允许相对偏差 10%;含磷量 0.5%以上，允许相对偏差 3%.
