InnoScan 生物芯片扫描仪在反向蛋白质微阵列上的应用
概述
本文描述的反相蛋白质微阵列 (RPPA) 平台位于巴黎（法国）居里研究所内。 该RPPA 平台的总体目标是通过信号通路分析提供关于蛋白表达水平及其活性的生物学新见解，最终目标是改善癌症患者的治疗和疗效。该平台使用高通量自动化设备（包括 InnoScan 710-IR 扫描仪）对各种类型的微量样品进行个性化蛋白质组学分析。 将介绍 RPPA 技术的基础知识，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成为该平台工作流程的重要组成部分。最后将描述居里研究所进行的癌症研究应用案例，以说明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微阵列 (RPPA) 是一种高通量小型化斑点印迹和基于抗体的技术（图 1A），可以分析蛋白表达水平和信号通路的激活状态（通过研究磷酸化或总蛋白表达）。它结合了高通量分析和消耗微量样品的优点。事实上，由于 RPPA 技术是一种多指标检测技术，因此可以在同一张覆有硝酸纤维素的载玻片芯片（微阵列）上同时分析多达一千个样本。RPPA 工作流程在图 1，B 中进行了描述。使用专用芯片点样仪，每个样品和每个点仅打印 1 至 2 ng 的细胞或组织裂解液。点样的样本可以是肿瘤样本、异种移植物、细胞系或这些样本的组合，并以连续稀释和复制的方式系统性地点样，使该技术具有高稳定性和数据可定量。然后，使用自动染色机，将微阵列按序与抗体和荧光染料孵育以检测感兴趣的蛋白（图 1A）：
在居里研究所，RPPA 平台测试了 2000 多种商业抗体，并验证了 640 种用于 RPPA 标记的一抗，其中近 150 种抗磷酸化蛋白。这组抗体涵盖了大多数细胞信号通路。对于每个项目，研究员从经过验证的抗体中选择感兴趣的抗体。 RPPA 平台不断评估新抗体，并验证特定抗体以满足合作者的要求。阳性和阴性对照使用标有总蛋白染色 FCF（来自 Grace Biolabs 的方案）标记的微阵列作为阳性对照，未标记一抗的微阵列作为阴性对照。在量化和数据分析之前（图 1C），用InnoScan 710-IR检测每个样品点的红外荧光。扫描仪有两个激发激光：785nm 和 670nm。得益于实时自动对焦和自动进样器，可以连续自动扫描 24 张芯片。10µm/像素扫描精度，在 4 分钟时间内完成一张载玻片芯片的扫描。载玻片上的硝酸纤维素在红色光谱中具有自发荧光。研究人员选择使用近红外荧光来降低硝酸纤维素的背景荧光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 规格完全符合需提供可靠数据的要求，其灵敏度与比色检测相似，但线性范围更宽。
图 1：反相蛋白质微阵列工作流程说明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑点印迹。在使用荧光标记抗体检测蛋白质之前，将蛋白质打印到硝酸纤维素膜载玻片上。 B. 从蛋白质提取到通过 InnoScan 710-IR采集图像的工作流程。 C. 使用 PARYS 软件对图像进行数据分析。
癌症研究的应用：
该RPPA 平台参与了多种项目，涵盖临床试验评估相关基本问题，对合作者提供的样本提供个性化的高通量蛋白质组学分析，允许：
宫颈癌 (CC)：RAIDs 联盟欧洲项目
宫颈癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常见的癌症。大多数宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒 (HPV) 的持续感染引起的。事实上，它们通过病毒蛋白 E6 和 E7 使正常细胞控制失效，导致基因组不稳定、分子改变的积累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 欧盟 (EU) 资助的研究在 2013 年至 2017 年间收集了前瞻性宫颈癌样本（肿瘤和血液）和临床数据集，涉及来自七个欧盟国家 18 个中心的 419 名参与患者。到目前为止，已经进行了下一代测序（NGS），能够解析显性遗传改变，并且应用反相蛋白质微阵列（RPPA）研究细胞信号通路。
居里研究所RPPA 平台处理了 280 个样本，包括基线和非基线肿瘤和细胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）进行样品处理（蛋白质提取、定量、连续稀释、阵列点印、标记、扫描、定量和分析）。
采用 194 种特异性一抗对蛋白质反向微阵列进行检测。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 扫描了355张载玻片微阵列 ，785 nm波段用于检测抗体或阴性对照，670nm波段用于检测阳性对照。
RPPA 蛋白表达数据的无监督聚类揭示了三个患者群，分别为富含 EMT（上皮间充质转化）、DNA 损伤信号和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，见图 2。与其他两个集群组合相比，“EMT”集群中的患者显示出更短的无进展生存期 (PFS), 见图 3（p=0.03）。
图 2：在基线肿瘤中，鉴定了具有不同蛋白质表达谱的三个主要簇。表征每个簇的蛋白质：簇 1富含EMT、ErbB 信号，簇 2富含DNA 损伤信号，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信号。
图 3：由 RPPA 分析定义的宫颈癌患者亚组无进展生存期（n=136）。 “EMT”簇（红色）与 DNA 损伤和 MAPK/PI3K 信号（蓝色）蛋白表达簇的结果比较表明，肿瘤显示 EMT 相关蛋白表达的患者无进展生存期较差。
此外，来自簇 1 样本的特征不仅在于 EMT，还在于 PD-L1（程序性死亡配体 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，对于含有 V 组结构域的 T 细胞激活抑制剂 1）的上调表达。见图 4。
PD-L1 属于 B7 蛋白家族。它是一种在抗原呈递细胞（和一些癌细胞）表面表达的蛋白质，与在T 细胞上的PD1 受体结合，当它与其受体连接时，通过抑制 T 细胞活化来调节免疫系统。
B7-H4 也属于 B7 蛋白家族，抑制 T 细胞活化、增殖、细胞因子产生和细胞毒性形成，负向调节 T 细胞介导的免疫反应。这就是为什么，在未来EMT 生物标志物有可能鉴定出能受益于免疫检查点抑制剂 (ICI) 疗法的患者。最后，基于 RPPA 技术，在三个簇中观察到 DNA 修复蛋白的表达和激活差异。这一结果可能会引起临床对 PARP 抑制剂治疗的兴趣。
图 4： RPPA 技术揭示的 PD-L1 和 B7-H4 的相对表达水平。 PD-L1 的高表达水平和 簇1 - EMT 的低表达水平。
肝细胞癌 (HCC) 项目
肝细胞癌 (HCC) 是异质性和侵袭性肿瘤。由于这种肿瘤分子机制的复杂性，目前的治疗方案在晚期阶段不是很有效，在生存方面的益处有限。
该项旨在发现可能对肝细胞癌有效的新化合物或分子和发现治疗反应生物标志物。该平台研究人员使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 个样本（包括 360 个人类肝肿瘤和非肿瘤组织以及 40 个肝癌衍生细胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各种信号通路的 126 种蛋白质； 82 种总蛋白和 44 种磷酸化蛋白，总共 215 张载玻片微阵列。在 LCCL 数据中，RPPA 结果的无监督聚类将 LCCL 分为 3 个亚组，这些亚组反映了转录组亚群和细胞分化状态（见图 5）。 
图 5：LCCL 蛋白质图谱的分层聚类以及与转录组亚群的关联（c2 检验）。第 1 簇：祖细胞亚类，第 2 组：混合上皮间充质，第 3 组：间充质样细胞
在簇 1（祖细胞亚类）中，肝特异性基因和胎/祖细胞标记物（ALDH1A1、E-钙粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、细胞角蛋白 19）表达良好，而它们在簇 3（间充质样细胞）中下调.
簇 2（混合上皮、间充质）和簇 3 有高表达水平的 TGF-β，没有典型的 β-连环蛋白和 EMT 蛋白，这表明这些细胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，见图 6 。
图 6：RPPA方法LCCL 蛋白质的相对表达水平。 LCCL 转录组亚组之间差异表达的 19 种蛋白质的箱线图（Mann-Whitney 检验）。
细胞系和肿瘤的 RPPA 数据结合基因组学和转录组学数据表明，肝癌细胞系的蛋白质谱似乎代表了来自患者的最具侵袭性肝细胞癌，是了解肝癌发展和药物反应的好工具。摘要如图 7 所示。
图 7：肝细胞癌分子分型。先前建立的肝细胞癌分子分型及其相应的肝癌衍生细胞系亚组与本研究中发现的主要药物与生物标志物的关联总结。从以前研究总结的肝细胞癌分子分型和相关特征。 Ampl，放大； mut，突变。
结论:
反相蛋白质微阵列是一种基于抗体的微型高通量技术，可以从少量生物样品中检测数百种蛋白质和磷酸化蛋白质。 RPPA 的灵敏度与 InnoScan 710-IR扫描仪相结合是完美的组合，可以为您的研究项目提供将磷酸化蛋白质组学方法与其他组学方法相结合的机会。这一强大的研究工具可帮助您研究信号通路，了解药物的作用机制，并为预后或治疗目标寻找新的生物标志物。
参考文献:
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
6) Caruso S. et al., (2019). Analysis of Liver Cancer Cell Lines Identifies Agents With Likely Efficacy Against Hepatocellular Carcinoma and Markers of Response. Gastroenterology.
7) Scholl S. et al., (2019). Clinical and genetic landscape of treatment naive cervical cancer: Alterations in PIK3CA and in epigenetic modulators associated with sub-optimal outcome. EBioMedicine.
本文描述的反相蛋白质微阵列 (RPPA) 平台位于巴黎（法国）居里研究所内。 该RPPA 平台的总体目标是通过信号通路分析提供关于蛋白表达水平及其活性的生物学新见解，最终目标是改善癌症患者的治疗和疗效。该平台使用高通量自动化设备（包括 InnoScan 710-IR 扫描仪）对各种类型的微量样品进行个性化蛋白质组学分析。 将介绍 RPPA 技术的基础知识，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成为该平台工作流程的重要组成部分。最后将描述居里研究所进行的癌症研究应用案例，以说明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微阵列 (RPPA) 是一种高通量小型化斑点印迹和基于抗体的技术（图 1A），可以分析蛋白表达水平和信号通路的激活状态（通过研究磷酸化或总蛋白表达）。它结合了高通量分析和消耗微量样品的优点。事实上，由于 RPPA 技术是一种多指标检测技术，因此可以在同一张覆有硝酸纤维素的载玻片芯片（微阵列）上同时分析多达一千个样本。RPPA 工作流程在图 1，B 中进行了描述。使用专用芯片点样仪，每个样品和每个点仅打印 1 至 2 ng 的细胞或组织裂解液。点样的样本可以是肿瘤样本、异种移植物、细胞系或这些样本的组合，并以连续稀释和复制的方式系统性地点样，使该技术具有高稳定性和数据可定量。然后，使用自动染色机，将微阵列按序与抗体和荧光染料孵育以检测感兴趣的蛋白（图 1A）：
在居里研究所，RPPA 平台测试了 2000 多种商业抗体，并验证了 640 种用于 RPPA 标记的一抗，其中近 150 种抗磷酸化蛋白。这组抗体涵盖了大多数细胞信号通路。对于每个项目，研究员从经过验证的抗体中选择感兴趣的抗体。 RPPA 平台不断评估新抗体，并验证特定抗体以满足合作者的要求。阳性和阴性对照使用标有总蛋白染色 FCF（来自 Grace Biolabs 的方案）标记的微阵列作为阳性对照，未标记一抗的微阵列作为阴性对照。在量化和数据分析之前（图 1C），用InnoScan 710-IR检测每个样品点的红外荧光。扫描仪有两个激发激光：785nm 和 670nm。得益于实时自动对焦和自动进样器，可以连续自动扫描 24 张芯片。10µm/像素扫描精度，在 4 分钟时间内完成一张载玻片芯片的扫描。载玻片上的硝酸纤维素在红色光谱中具有自发荧光。研究人员选择使用近红外荧光来降低硝酸纤维素的背景荧光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 规格完全符合需提供可靠数据的要求，其灵敏度与比色检测相似，但线性范围更宽。
图 1：反相蛋白质微阵列工作流程说明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑点印迹。在使用荧光标记抗体检测蛋白质之前，将蛋白质打印到硝酸纤维素膜载玻片上。 B. 从蛋白质提取到通过 InnoScan 710-IR采集图像的工作流程。 C. 使用 PARYS 软件对图像进行数据分析。
癌症研究的应用：
该RPPA 平台参与了多种项目，涵盖临床试验评估相关基本问题，对合作者提供的样本提供个性化的高通量蛋白质组学分析，允许：
- 蛋白表达水平分析
- 细胞信号通路激活状态及动态分析
- 预后或预测性生物标志物的鉴定
- 鉴定潜在治疗靶点
- 基于蛋白质谱的样品分类
- 药效学研究
宫颈癌 (CC)：RAIDs 联盟欧洲项目
宫颈癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常见的癌症。大多数宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒 (HPV) 的持续感染引起的。事实上，它们通过病毒蛋白 E6 和 E7 使正常细胞控制失效，导致基因组不稳定、分子改变的积累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 欧盟 (EU) 资助的研究在 2013 年至 2017 年间收集了前瞻性宫颈癌样本（肿瘤和血液）和临床数据集，涉及来自七个欧盟国家 18 个中心的 419 名参与患者。到目前为止，已经进行了下一代测序（NGS），能够解析显性遗传改变，并且应用反相蛋白质微阵列（RPPA）研究细胞信号通路。
居里研究所RPPA 平台处理了 280 个样本，包括基线和非基线肿瘤和细胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）进行样品处理（蛋白质提取、定量、连续稀释、阵列点印、标记、扫描、定量和分析）。
采用 194 种特异性一抗对蛋白质反向微阵列进行检测。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 扫描了355张载玻片微阵列 ，785 nm波段用于检测抗体或阴性对照，670nm波段用于检测阳性对照。
RPPA 蛋白表达数据的无监督聚类揭示了三个患者群，分别为富含 EMT（上皮间充质转化）、DNA 损伤信号和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，见图 2。与其他两个集群组合相比，“EMT”集群中的患者显示出更短的无进展生存期 (PFS), 见图 3（p=0.03）。
图 2：在基线肿瘤中，鉴定了具有不同蛋白质表达谱的三个主要簇。表征每个簇的蛋白质：簇 1富含EMT、ErbB 信号，簇 2富含DNA 损伤信号，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信号。
图 3：由 RPPA 分析定义的宫颈癌患者亚组无进展生存期（n=136）。 “EMT”簇（红色）与 DNA 损伤和 MAPK/PI3K 信号（蓝色）蛋白表达簇的结果比较表明，肿瘤显示 EMT 相关蛋白表达的患者无进展生存期较差。
此外，来自簇 1 样本的特征不仅在于 EMT，还在于 PD-L1（程序性死亡配体 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，对于含有 V 组结构域的 T 细胞激活抑制剂 1）的上调表达。见图 4。
PD-L1 属于 B7 蛋白家族。它是一种在抗原呈递细胞（和一些癌细胞）表面表达的蛋白质，与在T 细胞上的PD1 受体结合，当它与其受体连接时，通过抑制 T 细胞活化来调节免疫系统。
B7-H4 也属于 B7 蛋白家族，抑制 T 细胞活化、增殖、细胞因子产生和细胞毒性形成，负向调节 T 细胞介导的免疫反应。这就是为什么，在未来EMT 生物标志物有可能鉴定出能受益于免疫检查点抑制剂 (ICI) 疗法的患者。最后，基于 RPPA 技术，在三个簇中观察到 DNA 修复蛋白的表达和激活差异。这一结果可能会引起临床对 PARP 抑制剂治疗的兴趣。
肝细胞癌 (HCC) 项目
肝细胞癌 (HCC) 是异质性和侵袭性肿瘤。由于这种肿瘤分子机制的复杂性，目前的治疗方案在晚期阶段不是很有效，在生存方面的益处有限。
该项旨在发现可能对肝细胞癌有效的新化合物或分子和发现治疗反应生物标志物。该平台研究人员使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 个样本（包括 360 个人类肝肿瘤和非肿瘤组织以及 40 个肝癌衍生细胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各种信号通路的 126 种蛋白质； 82 种总蛋白和 44 种磷酸化蛋白，总共 215 张载玻片微阵列。在 LCCL 数据中，RPPA 结果的无监督聚类将 LCCL 分为 3 个亚组，这些亚组反映了转录组亚群和细胞分化状态（见图 5）。
图 5：LCCL 蛋白质图谱的分层聚类以及与转录组亚群的关联（c2 检验）。第 1 簇：祖细胞亚类，第 2 组：混合上皮间充质，第 3 组：间充质样细胞
在簇 1（祖细胞亚类）中，肝特异性基因和胎/祖细胞标记物（ALDH1A1、E-钙粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、细胞角蛋白 19）表达良好，而它们在簇 3（间充质样细胞）中下调.
簇 2（混合上皮、间充质）和簇 3 有高表达水平的 TGF-β，没有典型的 β-连环蛋白和 EMT 蛋白，这表明这些细胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，见图 6 。
图 6：RPPA方法LCCL 蛋白质的相对表达水平。 LCCL 转录组亚组之间差异表达的 19 种蛋白质的箱线图（Mann-Whitney 检验）。
细胞系和肿瘤的 RPPA 数据结合基因组学和转录组学数据表明，肝癌细胞系的蛋白质谱似乎代表了来自患者的最具侵袭性肝细胞癌，是了解肝癌发展和药物反应的好工具。摘要如图 7 所示。
图 7：肝细胞癌分子分型。先前建立的肝细胞癌分子分型及其相应的肝癌衍生细胞系亚组与本研究中发现的主要药物与生物标志物的关联总结。从以前研究总结的肝细胞癌分子分型和相关特征。 Ampl，放大； mut，突变。
结论:
反相蛋白质微阵列是一种基于抗体的微型高通量技术，可以从少量生物样品中检测数百种蛋白质和磷酸化蛋白质。 RPPA 的灵敏度与 InnoScan 710-IR扫描仪相结合是完美的组合，可以为您的研究项目提供将磷酸化蛋白质组学方法与其他组学方法相结合的机会。这一强大的研究工具可帮助您研究信号通路，了解药物的作用机制，并为预后或治疗目标寻找新的生物标志物。
参考文献:
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
6) Caruso S. et al., (2019). Analysis of Liver Cancer Cell Lines Identifies Agents With Likely Efficacy Against Hepatocellular Carcinoma and Markers of Response. Gastroenterology.
7) Scholl S. et al., (2019). Clinical and genetic landscape of treatment naive cervical cancer: Alterations in PIK3CA and in epigenetic modulators associated with sub-optimal outcome. EBioMedicine.
