基于肺炎儿童尿液外泌体蛋白组的生物标志物研究成果
目前病毒是导致全球范围内儿童肺炎最主要的病原菌之一，因此能够快速和准确的诊断病毒性肺炎是早期干预阻止病情进展的重要措施。但是病毒性肺炎和其他诸如细菌、肺炎支原体等引发的肺炎在临床表型上很难区分，病原菌检测有一定程度的滞后性，所以寻找可以替代诊断的生物标志物是临床诊断儿童肺炎的迫切需求。
前期的多项研究表明尿液外泌体可以作为诊断和评估很多疾病的潜在标志物。并且蛋白组学也揭示了尿液外泌体富含很多免疫相关分子1。因此探究尿液外泌体在感染性疾病中的潜在应用具有很大的价值。2023年1月12日，儿科学领域内的权威期刊Pediatric Research在线发表了上海儿童医学中心联合华盈生物共同开展的基于肺炎儿童尿液外泌体蛋白组的生物标志物研究成果2。
本项研究分为发现集和验证集，纳入了正常儿童、肺炎支原体肺炎儿童和病毒性肺炎儿童。发现阶段利用Exosome Isolation Q3 试剂盒提取尿液外泌体，进行label free蛋白组学。结果鉴定了1621个蛋白（unique peptides >2），结合文献数据库，排除与尿液高丰度蛋白THP共富集的蛋白组分以及可溶性蛋白组分后，总共1246个被认为是高可信的尿液外泌体蛋白，其中79%的蛋白可在外泌体蛋白数据库Exocarta检索到，典型的外泌体marker: CD9, CD81, TSG101, PDCD6IP (ALIX) 和CD63可在50%-100%的样本中被鉴定到，这些结果说明了高质量的尿液外泌体提取和蛋白组学数据（图1）。
图1 尿液外泌体的蛋白组学
PCA分析揭示了病毒性肺炎儿童的尿液外泌体蛋白组与肺炎支原体肺炎儿童和健康儿童间存在很显著的差异，特别是响应病毒感染的干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs)编码的蛋白显著富集在病毒性肺炎儿童的尿液外泌体中，并且部分病毒受体例如ACE2,ANPEP, DPP4 和 LAMP1在病毒性肺炎儿童的尿液外泌体中的表达高于健康儿童。我们又进一步的对260个与病毒感染相关的显著差异蛋白进行了功能富集分析，发现了这些差异蛋白参与到病毒感染和肺部感染的相关生物学过程和通路中，例如中性粒细胞活性、内吞、胞外基质、糖基化等代谢通路等（图2）。这些结果证实了尿液外泌体确实可以反映出宿主响应病原菌感染的分子变化，可以作为感染性疾病诊断的潜在标志物来源。
图2 尿液外泌体蛋白组学的功能分析
在本研究的初步验证阶段，我们又另外纳入了20名健康儿童、12名病毒性肺炎儿童和17名肺炎支原体肺炎儿童，同样利用Exosome Isolation Q3 试剂盒提取尿液外泌体开展基于多重反应监视（multiple reaction monitoring，MRM）的靶向蛋白组学分析。我们选择了33个与病毒感染相关的差异性蛋白，结果19个蛋白可被MRM成功检测到，定量分析发现了其中8个蛋白 (ANPEP, ASAH1, COL11A1, EHD4, HEXB, LGALS3BP, SERPINA1, SERPING1)的13个多肽只在病毒性肺炎儿童中显著高于健康儿童，说明了这8个蛋白可作为诊断儿童病毒性肺炎的潜在标志物进行后续的临床验证（图3）。
图3 MRM验证尿液外泌体蛋白
总结与讨论
尿液获取因为完全无创性，也成为检测肾脏、膀胱和尿道相关疾病标志物的来源。不仅如此，已有研究表明了尿液外泌体蛋白可以作为诊断多种神经系统疾病潜在标志物3，说明尿液也富含远端器官组织来源的外泌体，因此基于尿液外泌体开发疾病标志物具有非常大的应用前景。# 关于华盈 #
上海华盈生物医药科技有限公司（以下简称“华盈生物”）成立于2012年，是外泌体研究服务领域的领导品牌，拥有外泌体研究“一站式服务”体系，覆盖外泌体研究的方方面面，包括：外泌体的三项鉴定（电镜、WB、NTA）、外泌体蛋白组筛选（Labelﾠfree、DIA、PRM、MRM）、外泌体核酸筛选（miRNA、全转录组）、外泌体纳米流式检测、外泌体细胞&动物功能实验（PKH26/DiR/量子点、荧光示踪）等。华盈生物还自主研发了Exosome Isolation Q3 系列外泌体提取试剂盒，可以针对尿液、血清/浆、细胞上清等样本进行外泌体的分离，得到的外泌体可以进行下游的鉴定分析、RNA测序等。
多年来华盈生物服务客户已经覆盖国内各大著名的高校院所和多位院士课题组。华盈的专业和专注也已获得业界普遍认可，华盈生物外泌体研究合作伙伴的科研成果也先后在AdvﾠSci、JﾠClin Invest、Biomaterials、Cancer Res等著名期刊上发表。
参考文献
1. Hiemstra TF, Charles PD, Gracia T, Hester SS, Gatto L, Al-Lamki R et al. Human urinary exosomes as innate immune effectors. J Am Soc Nephrol. 2014;25(9):2017-27.
2. Cheng J, Ji D, Yin Y, Wang S, Pan Q, Zhang Q et al. Proteomic profiling of urinary small extracellular vesicles in children with pneumonia: a pilot study. Pediatr Res. 2023. Online ahead of print.
3. Wang S, Kojima K, Mobley JA, West AB. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 2019;45:351-361.
