新冠变异株如何逃避免疫应答？人ACE2转基因小鼠助力揭示免疫逃逸机制

近期，国家卫健委发布了两条消息，一是将新型冠状病毒肺炎更名为新型冠状病毒感染；二是对新型冠状病毒感染实施“乙类乙管”，随着全国各地陆续放宽限制，新冠病毒感染人数直线激增，中国进入“共存时代”。新冠病毒（SARS-CoV-2）为什么难以对付？这是由于在自然感染和疫苗接种带来的免疫压力下，病毒出现了多个变异株，能够逃避抗体的中和作用。

带有L452R突变的Delta变异株出现后，已迅速取代Alpha、Beta、Gamma和Kappa等变异株成为全球主要的流行毒株。早期流行的Omicron变异株BA.1对抗体敏感，但包含L452R的亚型迅速出现并扩散至全球多个国家和地区。

广州生物医药与健康研究院领导的研究团队近日鉴定了SARS-CoV-2感染引起的群体免疫应答，并探讨了SARS-CoV-2变异株如何出现并逃避宿主的免疫应答。这项成果于2022年9月下旬发表在《Nature Microbiology》杂志上。

研究材料与方法
在这项研究中，研究人员从6例新冠康复期患者身上采集了全血样本，并在Expi293F细胞和人ACE2转基因小鼠（由赛业生物提供）上开展实验。他们构建了噬菌体展示文库，并分离出与刺突蛋白RBD结合的抗体。他们通过冷冻电镜分析了抗原与抗体的结合，并通过生物膜干涉技术（BLI）测定了结合动力学和亲和力以及竞争性结合。

技术路线
01 构建噬菌体展示文库并分离与刺突蛋白RBD结合的抗体
02 通过冷冻电镜分析R1-32与刺突蛋白形成复合物的结构
03 通过抗体与刺突蛋白突变体的结合分析RBD替换对免疫逃逸的影响
04 鉴定SARS-CoV-2感染引起的群体免疫应答

研究结果
1.抗体R1-32中和了SARS-CoV-2变异株
研究人员对6例新冠恢复期患者外周血单核细胞中的抗体基因进行噬菌体展示，分离出6种与刺突蛋白的受体结合结构域（RBD）具有高亲和力的抗体。他们发现，R1-32抗体表现出最强的假病毒中和活性（IC90=9.95nM）。R1-32对Beta变异株和Omicron BA.1假病毒都保持了良好的中和作用，但对Delta变异株的中和作用被大大削弱。在人ACE2转基因小鼠（由赛业生物提供）上开展的实验表明，R1-32对SARS-CoV-2野生型病毒感染具有保护作用。

通过冷冻电镜分析，研究人员发现R1-32 Fab从刺突蛋白N端结构域（NTD）的上方接近并与RBD结合。通过改变Fab的量，他们发现R1-32结合促进RBD打开。后续分析发现，R1-32的HCDR2和HCDR3介导了它与RBD的互作（图1）。HCDR2表位包含疏水残基L452、F490和L492，而多个新冠病毒变异株的HCDR2表位发生氨基酸替换，使R1-32与RBD结合的亲和力大大降低，表明HCDR2表位内的L452和F490对抗体结合极其重要。
 

图1 R1-32与SARS-CoV-2刺突蛋白形成复合物的结构

 
当RBD处于down构象时，R1-32表位被部分掩盖，只有HCDR2表位完全暴露。这个半隐蔽的表位解释了为什么R1-32结合促使RBD采用up构象。进一步分析发现，与R1-32孵育的天然刺突蛋白分解成较小的结构，表明R1-32结合产生了不稳定的开放刺突蛋白结构。研究人员认为，R1-32很有可能通过破坏刺突蛋白的结构来抑制病毒细胞进入，从而中和病毒。

此外，他们发现R1-32及相关的FC08和52抗体均使用VH1-69基因作为重链可变区。它们以非常相似的方式与RBD结合，代表了一类独特的RBD靶向抗体。

2.L452的RBD替换与免疫逃逸有关
Delta变异株（L452R/T478K）在印度出现后取代Kappa等多个变异株成为流行毒株。研究人员发现，Delta变异株中的T478K对抗体结合没有影响，而L452R大大降低了R1-32和FC08与RBD的结合。基于这些结果，他们假设HCDR2表位452位点的替换可以逃避R1-32样抗体。

最早出现的Omicron变异株BA.1在452和490位不包含任何替换，与此一致，他们发现R1-32与Omicron BA.1 RBD/刺突蛋白三聚体以高亲和力结合，并中和Omicron BA.1假病毒。

研究人员推测R1-32样抗体可能在人群中很常见，于是搜索了20名COVID-19患者和25名健康供体的免疫球蛋白重链（IgH）库。他们在50%的COVID-19患者和24%的健康供体中检测到R1-32样IgH序列。COVID-19患者IGHV1-69编码库中的R1-32样IgH序列百分比显著高于健康供体，表明在暴露于SARS-CoV-2后该抗体谱系有明显的克隆扩增（图2）。