3D生物打印技术在人造和牛之日本科学家开发实验室培育肉中的应用
Michiya Matsusaki 教授在大阪大学的实验室中展示3D生物打印的“和牛”
如果您曾经去过日本并吃过日本著名的和牛（Wagyu），那您肯定知道这种特殊的牛肉会有多贵，这种和牛的价格超过400美元每公斤。不过，不用担心，这种情况很快就会发生改变。因为，在实验室培育的具有同等口感的和牛已经被3D生物打印出来了。
目前，日本科学家“Michiya Matsusaki”，使用3D生物打印技术，经成功地在实验室中获得了以具有大理石纹理脂肪而闻名的和牛（Wagyu）。
具有大理石纹理脂肪的和牛（Wagyu）
Michiya Matsusaki教授说：“和牛的脂肪具有大理石纹理的结构。因此，我们希望通过组装三种类型的细胞纤维（肌肉，脂肪和血管）来构建类似于和牛的大理石纹理结构”。让我们听一听他是怎么做的（视频1）。
Michiya Matsusaki教授还说：“如果我们能用几种细胞快速生产大量肉类，我们就有可能在未来更好地应对食物和蛋白质短缺问题”。Michiya Matsusaki教授还提到，3D生物打印和培养技术还可以应用于人类医学，例如，获得受损肌肉的替代品。Michiya Matsusaki教授将他的研究成果发表在自然杂志的子刊《Nature Communications》，在2021年其影响因子：15.861，发表文章数量超过7000篇。
那么，Michiya Matsusaki教授是如何制作出和牛的呢？让我们详细了解一下这个过程。文章的题目如下：
文章中介绍到
日本神户牛的“雪花牛肉”（和牛）里含有高达47.5%的脂肪，脂肪沉积到肌肉纤维之间，形成明显的红、白相间，状似大理石花纹的牛肉，含有大量人体所需的脂肪酸，营养价值比起普通牛肉高不少，而且口感极佳，极具有商业价值。
和牛的组成：
脂肪（Fat）
血管（Blood vessels）
肌肉纤维（Muscle fibers）
方法：HE染色
和牛的组成：
毛细血管（Capillaries）
方法：HE染色
和牛的组成：
胶原纤维（Collagen fibers）
方法：偶氮卡红染色
和牛的组成示意图
肌肉纤维被基底膜（basement membrane）覆盖，肌肉束被脂肪和毛细血管包围。
※调整脂肪组织、血管组织、肌肉纤维的比例、数量和位置是和牛的关键在建制造技术
如何通过实验室的方法获取上述的三种组织（脂肪、血管、肌肉纤维），并将其组装起来制造出“和牛”，是本文的关键所在。实验步骤如下：
1 分离、纯化细胞（bSCs、bADSCs）
bSCs：bovine satellite cells牛卫星细胞 ，用于分化成肌细胞，生成肌肉纤维
bADSCs：bovine adipose-derived stem cells牛脂肪源干细胞，（1）用于分化成脂肪细胞，生成脂肪组织。（2）用于分化成血管内皮细胞，生成血管组织。
bSCs分选：文献中选用不同的流式抗体对细胞进行筛选，筛选出CD31-、CD45-、CD56+、CD29+ 特性的细胞作为bSCs，可在DMEM中扩增（详细验证步骤请参考文献内容）。
这一步中可以使用分选仪对细胞进行分选：On-chip sort针对以往传统流式分选的弊端，推出的一款对细胞无损伤，确保临床应用的无污染，可以无菌处理操作的流式细胞仪。 使用微流控芯片模块，利用空气压力控制，对模块内的样品流进行细胞分离，可配置3激光6荧光。以低压对细胞进行分选，实现无损伤分离。
bADSCs分选：通过消化、过滤、清洗、细胞传代等方法获取bADSCs，可在DMEM中扩增（详细验证步骤请参考文献内容）。
2 细胞分化
（1）分离、提纯后的bSCs在传代增殖的过程中，通过添加胎牛血清（FBS）、碱性成纤维细胞生长因子、p38抑制剂来保持其分化能力。可以使用2%马血清（HS）的分化培养基进行诱导分化，诱导bSCs分化为肌肉细胞。验证后备用。
（2）分离、提纯、扩增后的bADSCs，可以使用ALK5i（TGF-β1抑制剂）诱导其分化为脂肪细胞，并且按一定配比添加七种游离脂肪酸，促进脂肪生成。生成脂肪细胞，验证后备用。
（3）分离、提纯、扩增后的bADSCs，可以使用DMEM + 10% HS（马血清）诱导bADSCs分化为血管内皮细胞，验证后备用。
3 通过3D生物打印机，打印3种组织纤维，促分化后组装
（1）打印方法
支持浴辅助3D打印（supporting bath-assisted 3D printing），该方法克服了超柔性墨水自身粘度、模量和重力的影响，降低了传统挤出3D生物打印技术对于打印结构的限制，有效地维持打印模型的稳定性。
（2）支持浴材料选择
Michiya Matsusaki教授选用明胶和结冷胶作为支持浴材料，因为它们具有可食用性，可去除性、细胞相容性。明胶在室温下是固态，在37 °C下是液态。结冷胶可以在pH 7.4和37℃下，在50mM Tris-HCl缓冲液中溶解。通过混合这两种胶与水凝胶一起配制支持浴。
视频2：文献中所用的支持浴辅助3D打印视频
Bio X系列3D生物打印机采用多打印头设计，可实现多种材料同时打印，结合最新开发的DNA studio4软件，可实现多种打印功能和打印场景。文献中提到的“支持浴辅助3D打印”，Bio X系列3D生物打印已经有相关应用、案例以及文献，可供参考。
Bio X系列用支持浴辅助3D打印技术，打印的血管结构和具有复杂结构的条状模型。
（3）细胞打印用生物墨水
DMEM 、基质胶以6:4混合、再添加20mg/mL纤维蛋白原的混合物。（以上材料均可在Cellink购买）
（4）细胞分化
3D生物打印完成后将组织纤维放置于具有不同粗分化因子的培养液中进行培养，并验证其分化情况。
4 和牛组装
Michiya Matsusaki教授共打印了42根肌肉细胞纤维、28根脂肪细胞纤维和2根血细胞管纤维。为了区分不同的纤维，使用食用色素将肌肉和血管细胞纤维染成红色，使脂肪细胞纤维染成白色。使用转谷氨酰胺酶（食物交联剂）处理细胞纤维，按一定比例将它们交联在一起，形成类似于和牛的结构。
总结
Michiya Matsusaki教授获取了bSCs和bADSCs通过支持浴辅助3D打印技术，打印了这两种细胞的纤维，并且促使其分化为肌肉细胞纤维、脂肪细胞纤维以及血管细胞纤维。通过组装，最终成功的获得了人工“和牛”。Michiya Matsusaki教授，还提到未来5年内，3D生物打印肉的产品即将商业化。
