单克隆抗体发现技术——单B细胞技术

单克隆抗体（mAb）具有高度的特异性，功能上远超多克隆抗体（pAb），是制药市场上最重要的生物药类型之一，被广泛用作高度特异性的诊断工具、治疗药物开发。自1986年美国FDA批准第一个治疗性mAb——OrthocloneOKT3（抗CD3mAb）以来，已有超过100个mAb获得FDA批准。
目前获得单克隆抗体的主要技术有哪些？
1）杂交瘤技术
杂交瘤技术是第一个开发用于分离mAb的技术，也称为B淋巴细胞（简称B细胞）永生化技术，自其发展以来，已经彻底改变了mAb的发现。该技术的原理是通过与骨髓瘤细胞融合使短寿命的B细胞永生化，产生单克隆永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步亚克隆循环以产生严格的单克隆性，通常亚克隆2~3个循环。

Fig.1 杂交瘤技术流程
不足之处：杂交瘤抗体开发周期长，不包括免疫，大约需要4-6个月。受杂交瘤融合率限制，整个B细胞群中只有一小部分B细胞完成融合，绝大部分丢失，不适于对大型抗体库进行全面筛选。此外，同一培养物中不同杂交瘤之间存在竞争，一些不分泌或低分泌克隆可能表现出更快的生长速度，超过高分泌克隆。
2）展示技术
发现和选择单克隆抗体的方法还有展示技术，如噬菌体、酵母展示。目前噬菌体展示已经成功地用于筛选大量抗体库。噬菌体展示技术的原理是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达，从而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面。

Fig.2 展示技术流程​
不足之处：抗体开发中获得天然VH-VL配对至关重要，然而展示技术通常依赖于随机组合，形成非自然的VH-VL抗体配对。有研究指出人类B细胞库的理论为10 ¹²-10 ¹⁸个，但由于样本量、V(D)J重组过程中插入的框外突变以及自反应BCR删除等原因，体内不同B细胞克隆的实际数量约为1×10 ⁷ –2×10 ⁷个，而在噬菌体等展示技术中，初始B细胞库的大小通常大于10 ⁹，数量远超天然B细胞库，VH-VL非天然配占比较大。
3）最新单抗发现技术-单B细胞抗体技术
原代抗原特异性B细胞是获得抗原特异性mAb的主要来源，单B细胞抗体技术可以以随机或抗原选择方式从外周血或淋巴组织中直接分离单B细胞。随机B细胞分离可以通过显微操作、激光捕获显微切割和荧光激活细胞分选（FACS）等方法进行细胞挑选。抗原选择可以通过使用抗原包被的磁珠、多参数FACS的荧光染料标记抗原、溶血斑块实验和荧光焦点等方法筛选抗原特异性B细胞。

Fig3. 单B细胞抗体技术流程
单B细胞抗体技术的优势
单B细胞抗体技术用相对较少的细胞，即可获得特异性单克隆抗体，mAb开发效率极高。单B细胞抗体技术可以分离出难以在体外模拟的构象决定因素的功能性mAb。FACS技术还可根据特定细胞表面marker的表达模式，清楚地区分待分选B细胞的发育和分化阶段，几乎任何阶段的B细胞都可以分选。通过单B细胞获得的mAb，体内天然成熟，对靶标具有相当高的特异性。此外，单B细胞抗体技术可以直接从人类标本或全人源转基因小鼠PBMC中获得人源抗体，方便快捷，远比通过其他物种（例如小鼠、大鼠和兔）的mAb进行人源化更容易、有效。德泰生物提供SingleB^®快速单抗发现服务，从动物免疫到100株单抗，仅需29天，比传统杂交瘤技术至少节省120天。直接筛选特异性记忆B细胞和浆细胞，抗体多样性丰富。