文献解读：cfDNA TAPS技术为早期癌症检测提供多模态信息
宋春啸博士，2013年获得美国芝加哥大学博士学位。2013年至2016年与美国斯坦福大学进行博士后研究。2016年起在英国牛津大学卢德维格癌症研究所任研究组长。
2019年宋春啸和他的科研伙伴Benjamin Schuster-Boeckler在Nature Biotechnology发表文章，报道了一种新的DNA甲基化测序方法TAPS技术，并从2019年4月到2021年9月陆续发表6篇TAPS技术相关高水平文章，内容覆盖TAPS在长读长测序的优势、不同表观遗传修饰的常见类型检测、甲基化及羟甲基化与BS方法对比等方面分析其方法的优势及可用性。
今天讲述的这篇文章主要是通过肝癌和胰腺癌构建甲基化模型证明TAPS方法的可行性。
文献背景：
①目前癌症的相关研究为治疗癌症提供了新方法，但早发现仍是治疗癌症的最佳机会。早期治疗不仅大大提高了患者的生存率，而且还大大降低了成本。然而现有检测方法还不能满足这一需求。循环细胞游离DNA(cfDNA)——血浆中游离的DNA，来源于各种健康和病变组织中的死亡细胞——在开发早期癌症检测方法方面具有巨大的潜力。
②cfDNA中的遗传信息（如突变和拷贝数变异(CNVs)）在监测癌症进展和治疗方面具有潜在的实用价值。然而，考虑到早期疾病中肿瘤ctDNA的比例较低，基因变异的检测具有挑战性。此外，基因突变对确定恶性肿瘤来源位置所需的起源组织的信息不足。相反，广泛的表观遗传变化，如癌细胞和肿瘤微环境的DNA甲基化，发生在肿瘤发生的早期。最近的研究表明，cfDNA甲基化是早期最有前途的癌症的生物标志物之一，它提供了数千种甲基化变化，可以结合起来克服检测限制和组织来源信息，从而允许高度可信的癌症定位。
③DNA甲基化通过全基因组、碱基分辨率和定量测序方法来确定，如亚硫酸氢盐测序。然而，亚硫酸氢盐测序对DNA损伤较为严重，且数据匹配率低测序成本昂贵，因此目前的cfDNA甲基化测序受到低深度、靶向或低分辨率和定性富集的测序的限制，因此不能完全捕获cfDNA甲基化组。
技术背景：
01 Bisulfite seq：
优势：甲基化样本前处理金标准，样本转化率高达99.5%，应用此技术绘制甲基化图谱（生长发育，肿瘤，复杂疾病等）
缺点：使用重亚硫酸盐处理，会导致样本损伤，被裂解成小于1.5kb的片段，部分区域会发生丢失；样本中C-T的转化降低了样本的复杂性，导致样本测序质量低，唯一匹配率较低（如图1）。
02 EM-seq：
优势：与金标准对比结果一致，转化率98-99%，使用酶法转化，反应温和，不会造成片段的损伤；数据质量较高，保留了原始样本的情况。
缺点：样本中C-T的转化降低了样本的复杂性，转化过程需两步完成，转化效率受实验员操作影响较大。
TAPS（宋春啸团队开发）：与金标准对比结果一致，使用酶法转化5mC-T（占比4%）等，反应温和，不会造成片段的损伤，片段可到10kb；样本复杂程度高，数据质量较高，唯一匹配率高，降低测序成本，且保留了原始样本的情况，可与其他变异做联合检测。
▲图源：Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution
实验设计：本文优化了cfDNA的TAPS(cfTAPS)，以仅从10ng的cfDNA中提供高质量和高深度的全基因组甲基化组，实验共计使用87例样本，其中2例样本转化效率低于85%，未计入后续分析样本情况，85个样本（HCC：21，PDAC：23，Control：30，胰腺炎：7，肝硬化：4，）的平均5mC转化率为97.0%。证明了来自cfTAPS的丰富信息能够整合差异甲基化、组织来源和片段谱的多模态表观遗传和遗传分析，从而准确区分HCC和PDAC患者和癌前炎症患者的cfDNA样本。
实验结果：
☞cfTAPS测序的适应
如图2：本图A,B展示了实验流程及转化原理，图C展示了87个cfDNA TAPS文库中的总reads、唯一匹配和去重唯一匹配数据占总数据比例的比较。图D基于已知位置有修饰或未修饰胞嘧啶的85个cfDNA TAPS文库的5mC转化率和假阳性率。基于未修饰扩增子峰值估计的假阳性率(未修饰C的转化率)为0.28%，证实了cfTAPS可以对cfDNA中5mC的高灵敏度和特异性检测。
☞来自cfTAPS的全基因组DNA甲基化
样本：52%的PDAC和67%的HCC患者处于I期和II期，对比了癌症和对照样本中 cfDNA 的全基因组甲基化比例。对照样本中的平均 CpG 甲基化水平与癌症 cfDNA 中相近，肝癌中仅很少的样本cfDNA发生整体低甲基化；对HCC和PDAC进行主成分分析，可以部分的和对照区分开；对HCC的主成分2相关性最高的前200个位点注释，发现富集在增强子上；对PDAC的主成分1相关性最高的前200个位点注释，发现富集在启动子上。
☞来自cfTAPS的差异DNA甲基化
基于HCC和对照中差异甲基化增强子的模型分类性能的ROC曲线和基于PDAC和对照之间差异甲基化启动子的模型分类性能的ROC曲线分别得到LOO癌症预测分数，此预测分数可将肝硬化的3例（共4例）和胰腺炎的6例（共7例）也与癌区分开。
☞cfTAPS组织的来源模型
文章整理了来自144个公开可获得的组织和血细胞WGBS的cpg水平的甲基化数据，并将其分为32种生理上不同的组织和血细胞类型，包括肝肿瘤组织。考虑到增强子区域中组织特异性DNA甲基化的普遍存在，我们构建了一个增强子聚集的组织甲基化参考图谱，通过执行非负最小二乘回归 (NNLS) 计算了 cfTAPS 样本中的组织贡献。我们观察到单独 HCC 中肝脏肿瘤的贡献显着增加和 PDAC 样本中记忆 T 细胞的贡献显着增加。cfTAPS为早期癌症检测提供了有价值的组织来源信息。
☞cfTAPS片段化模型
用cfTAPS检测到的cfDNA片段化模式与全基因组测序 (WGS)产生的cfDNA片段化模式一致，主峰位于167bp，次峰位于320 bp，并且低于 167 bp 的较小峰具有10 bp的周期性，反映了核小体断裂模式。同controls相比，癌症患者有较高比例的<150bp片段和较低比例的310-500bp片段。进一步证实cfTAPS保存了cfDNA的片段信息。
文章中开发了一种使用cfTAPS表征cfDNA片段化谱的新方法，但是与基于甲基化的模型相比，基于片段的模型不能很好地将肝硬化或者胰腺炎从癌症中区分开，说明片段携带的癌症特异信息较少。
☞使用cfTAPS进行多癌检测
为了进一步提升多癌种检测的性能，构建一个结合差异甲基化、组织溯源、片段模式三种特征的混合模型，联合模型的总体准确性（准确分类）达到0.86（64/74），区分癌和非癌的准确性0.92（68/74），突出多模态信息用于癌症类型预测的好处。
研究结论:
使用低起始量10ng的cfDNA构建甲基化文库，并应用于肝癌胰腺癌，有很好的表现，与cfDNA WGBS相比的优势在本研究中做了展示：①降低样本投入量，②得到更高的数据质量，③更全的甲基化位点模型，④更多遗传信息的保留；通过cfTAPS实现的深度测序，得到cfDNA甲基化和gDNA甲基化差异区，发现甲基化生物标志物的早期癌症检测。
在本研究中，从cfTAPS中提取CNVs和片段信息，后者在cfDNA WGBS中丢失。进一步证明了一种结合差异甲基化、组织起源和片段谱的综合方法可以提高多子检测的模型性能。
局限性:
二、由于有限的公开全基因组组织甲基化数据(例如，没有PDAC组织数据可用)，比较依赖数据WGBS数据库，现在的研究远没有开发出cfTAPS的组织起源信息的全部潜力。
