Ampha Z32花粉活力分析仪的应用：耐热辣椒品种评估及筛选
辣椒是重要的香料和蔬菜作物，在全球气候变暖的背景下，高温胁迫已成为辣椒产量和品质的主要限制因素，尤其是在热带和亚热带地区，因此培育耐热品种对于辣椒的持续生产至关重要。在辣椒等果实作物中，生殖发育尤其是花粉发育过程，对高温胁迫最为敏感，可作为耐热品种选育的指标。花粉活力和花粉萌发率通常主要通过染色法和显微镜检镜检来评估，这两种方法均操作繁琐、通量低且结果误差大，限制了其在育种中的应用。已有研究表明，Ampha Z32花粉活力分析仪（IFC，微流控阻抗流式细胞仪）是一种高效、非标记、可靠的单细胞检测技术，能够以独立于物种以高通量方式分析花粉活性。在本项研究中，科研人员利用Ampha Z32花粉活力分析仪针对21 个辣椒品种进行了三个独立的实验，从而确定了IFC法在评估辣椒花粉性状耐热性的有效性。
● 确定辣椒花粉性状（活性、浓度）评估的最佳时期；
● 评估不同品种辣椒花粉性状对不同热处理的响应，确定耐热性品种筛选的有效热处理温度；
● 染色法（花粉活力）、萌发法（花粉萌发率）验证IFC 法的（花粉活性）有效性，确定导致花粉性状差异性的最主要影响因素并筛选出耐热品种。
以上实验结果表明， IFC法是一种评估辣椒花粉性状的高效且准确的方法。本次实验为该领域的进一步研究提供了基础，可更有效地支持到耐热品种的选育中。
Ampha Z32花粉活力分析仪简介
Ampha Z32花粉活力分析仪细胞仪（瑞士Amphasys AG），通过检测流经交流电场的细胞悬浮液中细胞的电阻抗信号，分析获得细胞的数量、大小、活性。该仪器可以在0.3-30MHz的范围内同时测量4个不同频率下细胞的电阻抗特性，适配微流控芯片通道尺寸范围为15-400μm（图1B），可满足0-300μm范围内的任意生物、非生物单细胞的活性测量。
电场中活细胞的等效电路由电阻（细胞质）和电容（细胞膜）组成，在笛卡尔坐标系中，阻抗Z（ω）可以描述为实部分Zr（ω）或电阻与虚部分Zi（ω）或容性电抗的矢量和。
相位角（θ）描述电阻和电抗之间的关系：
阻抗指数即振幅表示为：
● 确定辣椒花粉性状评估的最佳时期
表1 辣椒花粉七个发育阶段的花粉浓度和花粉活性
本实验利用Ampha Z32花粉活力分析仪通过评估两个辣椒品种在七个花粉发育阶段的花粉浓度和花粉活力来确定花粉性状评估的最佳时期。实验结果表明，开花时期是造成花粉浓度和花粉活性差异的主要原因，此外花粉活性还受品种影响。如表1所示，平均花粉浓度为8889粒/ml，其中ST5期花粉浓度最高，ST4期次之，ST2期花粉浓度最低；平均花粉活性为52%，活性最高的是ST3 期(79.3%)、ST2期 (71.4%) 和 ST1期 (69.7%)，其次是 ST4期(53.3%) 和 ST5期 (52.2%)，开花末期即ST7的花粉活性最低，仅为14.7%。品种9852-123的花粉活性（71%）显著高于品种AVPP9823（33%）（图2）。
● 确定耐热辣椒品种筛选有效热处理温度
本实验通过评估5个辣椒品种在5个热处理下（41、44、47、50 及 55°C）和对照组的花粉性状差异，确定了筛选耐热性辣椒品种的有效热处理温度。实验结果表明，热处理对花粉活性的影响显著（P<0.001）；热处理和品种的综合效应显著影响花粉浓度（P<0.001）。热处理下的平均花粉活性为72%，其中44℃（83%）和47℃（82%）处理下的花粉活性与对照组（88%）无明显差异，41℃（82%）的花粉活性略低于对照组，50℃（69%），55℃（27%）处理下的花粉活性最低（表2）。热处理下的平均花粉浓度为13622粒/ml，其中花粉浓度最高的是55℃热处理下的品种AVPP1704，其次在 47°C处理下的 AVPP1708，而41 ℃和50°C 热处理下的品种 1607-7031-1 和在50°C 热处理下 AVPP1704花粉浓度最低（表3）。
表2 5个辣椒品种的对照组和5个热处理温度下的平均花粉活性(%)
表3 5个辣椒品种的对照组和5个热处理温度下的平均花粉浓度
● 验证IFC法检测花粉活性的有效性
本实验于4月（较冷月）和6月（较热月）分别利用Ampha Z32花粉活力分析仪、染色法和萌发法评估了21个辣椒品种在未经处理和45℃或50℃处理下的花粉活性（IFC法）、花粉浓度、花粉活力（染色法）、花粉萌发率（萌发法）和花粉管长度（萌发法），以验证IFC法在检测花粉活性的有效性。实验结果显示，不同月份下，处于不同处理条件的不同品种的花粉萌发率和花粉管长度差异显著；不同月份下的不同处理间及不同月份下的不同品种间的花粉浓度和花粉活力均差异显著；而不同月份下的不同品种间及不同月份下的不同品种在不同处理下的花粉活性差异显著。由此可见，月份是造成花粉活性（MS=9.3）、花粉浓度（1.1×）、花粉萌发（MS=112.4）和花粉活力（MS=0.6）差异的最主要影响因子，而热处理是造成花粉管长度差异的最主要影响因子（MS=40764）。
本实验同时使用染色法验证了IFC法在检测花粉活性中的有效性，结果表明花粉活力（染色法）和花粉活性（IFC法）之间存在显着（P=0.0001）正相关（=0.53）（图11）。
● 结论
精准筛选是成功培育特定性状的首要条件之一。耐热性是由几个性状组成的复杂表型，辣椒等结果型作物最主要的耐热性性状涉及生殖组织，尤其是花粉。而传统上通常使用染色镜检来评估花粉活力，这些方法普遍统计性有限（花粉粒≈100），且检测策略繁琐耗时，且可能不准确。为了克服这些局限性，Heidmann等人（2016年）提出使用IFC筛选辣椒和其他作物在高温胁迫下的花粉发育过程和花粉活力，本次研究进一步确认IFC评估辣椒花粉的适用性。
实验结果表明， IFC可以区分可萌发的活花粉（活性花粉）、不能萌发的活花粉（非活性花粉）和无活力的花粉，其中幼龄花粉（第 1 和第 2 阶段）和开花前的花粉（第3 阶段）具有较高比例的活性花粉，然而花粉浓度（从花药开裂的花粉）在第 2 阶段最低，在开花前后更高（表 1）。由IFC法可确定评估辣椒花粉耐热性的临界温度是 50°C，高于 47°C 的所有温度下，花粉活性都显著下降，其中55°C的花粉活性最低，这与Heidmann等人（2016年）的研究结果一致。热处理和品种的相互作用下导致花粉浓度的差异，这与此前野生和栽培番茄、不同豆类品种以及榛子品种的研究结果一致。已有研究证实，高温会导致花粉活力下降，辣椒在坐果期间，气温在18到32°C之间时产量会更高。生长月份是导致本次研究中除花粉管长度外的其他性状差异性的主要因素，本次实验的4月份，除上午11:00到下午4:00间的温度超过32°C，其他时间的温度均在辣椒的最佳生长温度范围内，而6月温度从上午8:00起就超过32°C，直到下午6:00之后才下降，4月的最佳生长条件显然有助于提高这些品种中几乎所有性状的表现，但此期间的热处理在区分耐热和热敏性品种方面仍然非常有效，本次研究筛选出PBC 507 和 PBC 831两个耐热性品种。染色法的花粉活力和使用 IFC法 的花粉活性结果显著正相关性，表明IFC适用于热胁迫条件下评估辣椒花粉的质量。
总之，IFC法是一种检测快速、操作简单、通量且准确性高的检测方法，可应用于育种方案中评估大量种质资源和耐热性表型性状的筛选。
—— 原文阅读 ——
S Lin, T Lin, CKMYee, J Chen, et al. Impedance Flow Cytometry for Selection of Pollen Traits UnderHigh Temperature Stress in Pepper. HortScience. 57(2) : 181-190. 2022
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小满者，物至于此小得盈满。
● 确定辣椒花粉性状（活性、浓度）评估的最佳时期；
● 评估不同品种辣椒花粉性状对不同热处理的响应，确定耐热性品种筛选的有效热处理温度；
● 染色法（花粉活力）、萌发法（花粉萌发率）验证IFC 法的（花粉活性）有效性，确定导致花粉性状差异性的最主要影响因素并筛选出耐热品种。
以上实验结果表明， IFC法是一种评估辣椒花粉性状的高效且准确的方法。本次实验为该领域的进一步研究提供了基础，可更有效地支持到耐热品种的选育中。
Ampha Z32花粉活力分析仪简介
Ampha Z32花粉活力分析仪（瑞士Amphasys AG）信号的采集和转导
A）细胞在不同频率的交流电场中的检测结果，低频下反映细胞的体积特性，高频下反映细胞膜的介电特性即细胞活性；B) 微流控芯片；C）流经交流电场的细胞的阻抗信号（蓝色实部即电阻信号，绿色虚部即容性电抗信号），细胞膜完整性决定容性电抗的大小，故可通过虚部信号来区分活细胞和死细胞，最终以阻抗相位角-振幅散点图反映出来Ampha Z32花粉活力分析仪细胞仪（瑞士Amphasys AG），通过检测流经交流电场的细胞悬浮液中细胞的电阻抗信号，分析获得细胞的数量、大小、活性。该仪器可以在0.3-30MHz的范围内同时测量4个不同频率下细胞的电阻抗特性，适配微流控芯片通道尺寸范围为15-400μm（图1B），可满足0-300μm范围内的任意生物、非生物单细胞的活性测量。
电场中活细胞的等效电路由电阻（细胞质）和电容（细胞膜）组成，在笛卡尔坐标系中，阻抗Z（ω）可以描述为实部分Zr（ω）或电阻与虚部分Zi（ω）或容性电抗的矢量和。
相位角（θ）描述电阻和电抗之间的关系：
阻抗指数即振幅表示为：
● 确定辣椒花粉性状评估的最佳时期
图1 辣椒花蕾(花粉)的7个发育阶段(从左至右ST1至ST7)）
ST1：尚未着色的未成熟小花蕾；ST2：花瓣几乎完全着色的较大未成熟花蕾；ST3：完全着色的成熟花蕾；ST4：可见少量花粉的开放花朵；ST5：可见较大量花粉的开放花朵；ST6：花粉量丰富的完全开放花朵；ST7：变色(棕褐色或黄色)的花朵。表1 辣椒花粉七个发育阶段的花粉浓度和花粉活性
本实验利用Ampha Z32花粉活力分析仪通过评估两个辣椒品种在七个花粉发育阶段的花粉浓度和花粉活力来确定花粉性状评估的最佳时期。实验结果表明，开花时期是造成花粉浓度和花粉活性差异的主要原因，此外花粉活性还受品种影响。如表1所示，平均花粉浓度为8889粒/ml，其中ST5期花粉浓度最高，ST4期次之，ST2期花粉浓度最低；平均花粉活性为52%，活性最高的是ST3 期(79.3%)、ST2期 (71.4%) 和 ST1期 (69.7%)，其次是 ST4期(53.3%) 和 ST5期 (52.2%)，开花末期即ST7的花粉活性最低，仅为14.7%。品种9852-123的花粉活性（71%）显著高于品种AVPP9823（33%）（图2）。
图2 2个辣椒品种的7个花粉发育阶段(ST1–ST7)的平均花粉活性(%)
● 确定耐热辣椒品种筛选有效热处理温度
本实验通过评估5个辣椒品种在5个热处理下（41、44、47、50 及 55°C）和对照组的花粉性状差异，确定了筛选耐热性辣椒品种的有效热处理温度。实验结果表明，热处理对花粉活性的影响显著（P<0.001）；热处理和品种的综合效应显著影响花粉浓度（P<0.001）。热处理下的平均花粉活性为72%，其中44℃（83%）和47℃（82%）处理下的花粉活性与对照组（88%）无明显差异，41℃（82%）的花粉活性略低于对照组，50℃（69%），55℃（27%）处理下的花粉活性最低（表2）。热处理下的平均花粉浓度为13622粒/ml，其中花粉浓度最高的是55℃热处理下的品种AVPP1704，其次在 47°C处理下的 AVPP1708，而41 ℃和50°C 热处理下的品种 1607-7031-1 和在50°C 热处理下 AVPP1704花粉浓度最低（表3）。
表2 5个辣椒品种的对照组和5个热处理温度下的平均花粉活性(%)
表3 5个辣椒品种的对照组和5个热处理温度下的平均花粉浓度
● 验证IFC法检测花粉活性的有效性
本实验于4月（较冷月）和6月（较热月）分别利用Ampha Z32花粉活力分析仪、染色法和萌发法评估了21个辣椒品种在未经处理和45℃或50℃处理下的花粉活性（IFC法）、花粉浓度、花粉活力（染色法）、花粉萌发率（萌发法）和花粉管长度（萌发法），以验证IFC法在检测花粉活性的有效性。实验结果显示，不同月份下，处于不同处理条件的不同品种的花粉萌发率和花粉管长度差异显著；不同月份下的不同处理间及不同月份下的不同品种间的花粉浓度和花粉活力均差异显著；而不同月份下的不同品种间及不同月份下的不同品种在不同处理下的花粉活性差异显著。由此可见，月份是造成花粉活性（MS=9.3）、花粉浓度（1.1×）、花粉萌发（MS=112.4）和花粉活力（MS=0.6）差异的最主要影响因子，而热处理是造成花粉管长度差异的最主要影响因子（MS=40764）。
图3 21 个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的不同热处理下(45℃、50°C及F对照组)的花粉萌发率
图4 21 个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的不同热处理下(45℃、50°C及F对照组)的花粉管长度(mm)
图5 21 个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的花粉活性(%)
图6 21 个辣椒品种在不同热处理下(45℃、50°C及F对照组)的花粉活性(%)
图7 21 个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的花粉活力(%)
图8 21个辣椒品种4月(较冷月)和 6月(较热月)的花粉活力(%)
图9 21 个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的花粉浓度(粒/mL)
图10 不同处理下的 21个辣椒品种在4月(较冷月)和 6月(较热月)的花粉浓度(粒/mL)
本实验同时使用染色法验证了IFC法在检测花粉活性中的有效性，结果表明花粉活力（染色法）和花粉活性（IFC法）之间存在显着（P=0.0001）正相关（=0.53）（图11）。
图11 阻抗流式细胞仪(IFC)测定的花粉活性与染色评估的花粉活力之间的相关性
● 结论
精准筛选是成功培育特定性状的首要条件之一。耐热性是由几个性状组成的复杂表型，辣椒等结果型作物最主要的耐热性性状涉及生殖组织，尤其是花粉。而传统上通常使用染色镜检来评估花粉活力，这些方法普遍统计性有限（花粉粒≈100），且检测策略繁琐耗时，且可能不准确。为了克服这些局限性，Heidmann等人（2016年）提出使用IFC筛选辣椒和其他作物在高温胁迫下的花粉发育过程和花粉活力，本次研究进一步确认IFC评估辣椒花粉的适用性。
实验结果表明， IFC可以区分可萌发的活花粉（活性花粉）、不能萌发的活花粉（非活性花粉）和无活力的花粉，其中幼龄花粉（第 1 和第 2 阶段）和开花前的花粉（第3 阶段）具有较高比例的活性花粉，然而花粉浓度（从花药开裂的花粉）在第 2 阶段最低，在开花前后更高（表 1）。由IFC法可确定评估辣椒花粉耐热性的临界温度是 50°C，高于 47°C 的所有温度下，花粉活性都显著下降，其中55°C的花粉活性最低，这与Heidmann等人（2016年）的研究结果一致。热处理和品种的相互作用下导致花粉浓度的差异，这与此前野生和栽培番茄、不同豆类品种以及榛子品种的研究结果一致。已有研究证实，高温会导致花粉活力下降，辣椒在坐果期间，气温在18到32°C之间时产量会更高。生长月份是导致本次研究中除花粉管长度外的其他性状差异性的主要因素，本次实验的4月份，除上午11:00到下午4:00间的温度超过32°C，其他时间的温度均在辣椒的最佳生长温度范围内，而6月温度从上午8:00起就超过32°C，直到下午6:00之后才下降，4月的最佳生长条件显然有助于提高这些品种中几乎所有性状的表现，但此期间的热处理在区分耐热和热敏性品种方面仍然非常有效，本次研究筛选出PBC 507 和 PBC 831两个耐热性品种。染色法的花粉活力和使用 IFC法 的花粉活性结果显著正相关性，表明IFC适用于热胁迫条件下评估辣椒花粉的质量。
总之，IFC法是一种检测快速、操作简单、通量且准确性高的检测方法，可应用于育种方案中评估大量种质资源和耐热性表型性状的筛选。
—— 原文阅读 ——
S Lin, T Lin, CKMYee, J Chen, et al. Impedance Flow Cytometry for Selection of Pollen Traits UnderHigh Temperature Stress in Pepper. HortScience. 57(2) : 181-190. 2022
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• 瑞士Amphasys发布新一代花粉活力分析仪Ampha Z40
• Ampha Z32花粉活力分析仪在茄子和辣椒育种中的应用
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小满者，物至于此小得盈满。
