Minibox平行生物反应器在提高菌株生产鲁棒性研究上的应用
微生物产业是国家战略性新兴产业。国家发展改革委于5月10日发布了《“十四五”生物经济发展规划》，明确了生物经济发展的具体任务是推动生物燃料与生物化工融合发展。
图片来源：【国家发展改革委举行新闻发布会 介绍“十四五”生物经济发展规划有关情况】-国家发展和改革委员会 (ndrc.gov.cn)
美国制定了《生物质技术路线图》（2002年），计划到2030年，生物基产品替代有机化学品的比例达到25%，生物能源替代运输用石油燃料的比例达到20%，相关产品绝大部分来自微生物制造；基于微生物生产化学品和燃料的产业正不断增长，并且在全球经济中发挥着越来越重要的作用，其在美国就占到了国民生产总值（GDP）的2%以上。
然而，微生物在工业生产过程中会遭遇到多种逆境压力，例如高温、低温、酸、氧化、渗透压力或者营养缺乏，会影响细胞生长和生产能力，导致减产。比如在氨基酸或有机酸生产中，酸性代谢物在发酵培养基中的逐渐积累会使菌株遭受酸压力。尽管可以通过在培养基中添加碱性物质来减少酸压力产生的负面影响，但同时也将增加下游分离成本、废水和固废的排放。
细胞对环境压力的耐受性改造工程一直是生物制造业需要解决的关键问题。因此，科学家们提出对耐酸菌株的设计和筛选将会是一种更智能和更具成本效益的解决方案。虽然合成生物学理论上为设计这种耐受菌株提供了多种基因组进化策略，但难以从数百个与压力相关的基因中选择出少数关键基因，组装成有效的抗逆模块。近期，在《Microbial Cell Factories》杂志上发表的文章“Synthetic acid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivity of industrial Escherichia coli in fermentation at low pH ”中，华南理工大学联合中粮营养与健康研究院、上海交通大学研究团队巧妙地设计了一组合成抗酸模块，通过微调少数基因的表达量即可有效提高菌株的酸耐受性。该模块由质子消耗系统基因（gadE），蛋白质保护与质量控制系统基因（hdeB）和抗氧化酶系统基因（sodB和katE）组成，并通过酸响应启动子进行调控。
首先，研究者们使用定向进化的方法，对酸响应性酸性休克RNA（asr）的启动子进行改造，构建酸响应性asr启动子突变库，基于荧光蛋白的表达进行筛选获得49个不同强度的酸响应asr启动子。从中选择四种变体具有不同强度的启动子突变体以实现基因的适量表达，从而构建一系列的合成抗酸模块。
asr启动子突变库pH响应比率大于1.8的启动子在pH 7.0或pH 5.0 LBG的相对强度及对应的pH响应比率。
进一步，为了研究所选基因在中度酸性（pH 5.0）环境下对大肠杆菌耐酸性的影响，分别对gadE、hdeB、sodB、katE和katE-sodB进行单独过表达的酸生长测试（如下所示）。接着，在4种不同强度的asr启动子突变体P24E8、P10G6、P77C4和P50G1的控制下，组装4个基因gadE、hdeB、sodB、katE构建合成抗酸模块。
为了评估合成抗酸模块是否能提高工业大肠杆菌的生产性能，研究者建立了大肠杆菌抗酸模块逐级评估方法，对合成抗酸模块进行从实验室菌株、实验室培养基到工业生产菌株、工业培养基条件下的性能评估。首先使用实验室测试菌株E. coli MG1655在微孔板中（一次可测试200个样）进行生长测试，然后使用工业赖氨酸生产菌株E. coli MG1655 SCEcL3在10-mL微生物反应器中（一次可测试24个样）进行微型发酵筛选测试。
10ml微生物反应器中合成耐酸模块对赖氨酸滴度的影响
最后在1.3-L x 8组的平行生物反应器（Minibox，T&J 迪必尔生物工程（上海）有限公司）中测试合成抗酸模块对赖氨酸生产性能的影响。在Minibox 1.3-L x 8组的平行生物反应器培养过程中，首先将细胞在种子培养基中活化，以1%（v / v）接种量接种到含有100 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，在摇床中37°C、250 rpm培养到OD600为2.0-3.0，然后将75 mL种子液接种到含425 mL发酵培养基的1.3-L平行生物反应器中。在线监测DO、pH和温度。通过流加5%（w / v）氨水将培养基的pH值控制在6.8或6.0。在48 h发酵期间，DO、温度和葡萄糖分别控制在40-60%，37.0 ± 0.1°C和0.4-1.0%（w / v）。并通过调节搅拌速率从200到1000 rpm进行控制，通气速率为0.5 vvm。定期采集样品以测量光密度，残留葡萄糖和赖氨酸产量。
1.3-L平行生物反应器水平上，合成抗酸模块对赖氨酸发酵中生产性能的影响
T&J 迪必尔生物Minibox 1.3-L平行生物反应器
使用Minibox平行反应器大大加速了研发进程，最终筛选得到能最大提高菌株生产性能的合成抗酸模块，使工程菌株在pH 6.0下的产量与pH 6.8下的亲本菌株产量和糖酸转化率相当，菌株耐酸性能得到提高。
该研究构建了酸响应启动子库，构建了含有限4个基因构成的合成抗酸模块，并发展了抗酸模块逐级评估方法，实现了赖氨酸工业生产菌株耐酸性能的有效提升（耐受pH值下降1个单位），为提高工业微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且丰富了合成生物学元器件库。
参考文献：
1. Yao, X., Liu, P., Chen, B. et al. Syntheticacid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivityof industrial Escherichia coli in fermentation at lowpH. Microb Cell Fact 21, 68 (2022).https://doi.org/10.1186/s12934-022-01795-4
图片来源：【国家发展改革委举行新闻发布会 介绍“十四五”生物经济发展规划有关情况】-国家发展和改革委员会 (ndrc.gov.cn)
美国制定了《生物质技术路线图》（2002年），计划到2030年，生物基产品替代有机化学品的比例达到25%，生物能源替代运输用石油燃料的比例达到20%，相关产品绝大部分来自微生物制造；基于微生物生产化学品和燃料的产业正不断增长，并且在全球经济中发挥着越来越重要的作用，其在美国就占到了国民生产总值（GDP）的2%以上。
然而，微生物在工业生产过程中会遭遇到多种逆境压力，例如高温、低温、酸、氧化、渗透压力或者营养缺乏，会影响细胞生长和生产能力，导致减产。比如在氨基酸或有机酸生产中，酸性代谢物在发酵培养基中的逐渐积累会使菌株遭受酸压力。尽管可以通过在培养基中添加碱性物质来减少酸压力产生的负面影响，但同时也将增加下游分离成本、废水和固废的排放。
细胞对环境压力的耐受性改造工程一直是生物制造业需要解决的关键问题。因此，科学家们提出对耐酸菌株的设计和筛选将会是一种更智能和更具成本效益的解决方案。虽然合成生物学理论上为设计这种耐受菌株提供了多种基因组进化策略，但难以从数百个与压力相关的基因中选择出少数关键基因，组装成有效的抗逆模块。近期，在《Microbial Cell Factories》杂志上发表的文章“Synthetic acid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivity of industrial Escherichia coli in fermentation at low pH ”中，华南理工大学联合中粮营养与健康研究院、上海交通大学研究团队巧妙地设计了一组合成抗酸模块，通过微调少数基因的表达量即可有效提高菌株的酸耐受性。该模块由质子消耗系统基因（gadE），蛋白质保护与质量控制系统基因（hdeB）和抗氧化酶系统基因（sodB和katE）组成，并通过酸响应启动子进行调控。
首先，研究者们使用定向进化的方法，对酸响应性酸性休克RNA（asr）的启动子进行改造，构建酸响应性asr启动子突变库，基于荧光蛋白的表达进行筛选获得49个不同强度的酸响应asr启动子。从中选择四种变体具有不同强度的启动子突变体以实现基因的适量表达，从而构建一系列的合成抗酸模块。
asr启动子突变库pH响应比率大于1.8的启动子在pH 7.0或pH 5.0 LBG的相对强度及对应的pH响应比率。
进一步，为了研究所选基因在中度酸性（pH 5.0）环境下对大肠杆菌耐酸性的影响，分别对gadE、hdeB、sodB、katE和katE-sodB进行单独过表达的酸生长测试（如下所示）。接着，在4种不同强度的asr启动子突变体P24E8、P10G6、P77C4和P50G1的控制下，组装4个基因gadE、hdeB、sodB、katE构建合成抗酸模块。
10ml微生物反应器中合成耐酸模块对赖氨酸滴度的影响
最后在1.3-L x 8组的平行生物反应器（Minibox，T&J 迪必尔生物工程（上海）有限公司）中测试合成抗酸模块对赖氨酸生产性能的影响。在Minibox 1.3-L x 8组的平行生物反应器培养过程中，首先将细胞在种子培养基中活化，以1%（v / v）接种量接种到含有100 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，在摇床中37°C、250 rpm培养到OD600为2.0-3.0，然后将75 mL种子液接种到含425 mL发酵培养基的1.3-L平行生物反应器中。在线监测DO、pH和温度。通过流加5%（w / v）氨水将培养基的pH值控制在6.8或6.0。在48 h发酵期间，DO、温度和葡萄糖分别控制在40-60%，37.0 ± 0.1°C和0.4-1.0%（w / v）。并通过调节搅拌速率从200到1000 rpm进行控制，通气速率为0.5 vvm。定期采集样品以测量光密度，残留葡萄糖和赖氨酸产量。
1.3-L平行生物反应器水平上，合成抗酸模块对赖氨酸发酵中生产性能的影响
T&J 迪必尔生物Minibox 1.3-L平行生物反应器
使用Minibox平行反应器大大加速了研发进程，最终筛选得到能最大提高菌株生产性能的合成抗酸模块，使工程菌株在pH 6.0下的产量与pH 6.8下的亲本菌株产量和糖酸转化率相当，菌株耐酸性能得到提高。
该研究构建了酸响应启动子库，构建了含有限4个基因构成的合成抗酸模块，并发展了抗酸模块逐级评估方法，实现了赖氨酸工业生产菌株耐酸性能的有效提升（耐受pH值下降1个单位），为提高工业微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且丰富了合成生物学元器件库。
参考文献：
1. Yao, X., Liu, P., Chen, B. et al. Syntheticacid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivityof industrial Escherichia coli in fermentation at lowpH. Microb Cell Fact 21, 68 (2022).https://doi.org/10.1186/s12934-022-01795-4
标签：
生物能源
