qPCR扩增过程中影响Ct值的因素及解决办法详解

导读

Ct值是荧光定量PCR重要的结果呈现形式，它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大被认为是合理？如何保证Ct值的有效范围呢？

  Ct值以及Ct值的作用：

Ct值概念：

也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。其含义是：在PCR 循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

Ct值的作用：

1）Ct值的重现性，PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

注：模板为105k拷贝GAPDH，用GAPDH引物扩增。96个孔重复结果的Ct平均值为19.1，变异系数（Cv）=0.002.

2）Ct值与起始模板的线性关系，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用标准曲线定量的方法。

注：样本进行10倍的倍比稀释后进行荧光定量检测得到的Ct值。

  合理的Ct值范围：

Ct值的范围为15-35，Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。

  影响Ct值的因素及解决办法：

由扩增循环数和产物量之间的关系：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数，可以看出，在理想条件下，起始模板量和En（扩增效率）会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。

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