单细胞转录组+16s联合肠道微生物揭示乳酸菌化身胰腺癌“帮凶”的机制
研究材料
荷瘤小鼠；AhR缺陷型荷瘤小鼠
技术路线
· 步骤1：转录组数据揭示AhR控制胰腺癌中肿瘤相关巨噬细胞的功能；
· 步骤2：单细胞转录组验证巨噬细胞中AhR功能对胰腺癌的影响；
· 步骤3：微生物测序结果表明AhR在肿瘤巨噬细胞中被乳酸菌产生的色氨酸代谢物激活；
· 步骤4：膳食色氨酸是PDAC TME中免疫表型的关键驱动因素；
· 步骤5：AhR在人肿瘤巨噬细胞中表达富集，并与生存相关。
研究结果
1. AhR是促肿瘤表型的关键驱动因素
为了了解巨噬细胞在胰腺导管腺癌（PDAC）中的作用，作者首先比较了PDAC中TAM和正常巨噬细胞的转录组数据，结果TAM显示出880个基因的上调表达，包括促癌基因Arg1、Nos2和Cd274，以及编码AhR的基因Cyp1b1。
前人的研究表明，AhR是一种有效的免疫调节因子，为了测试AhR在PDAC中是否具有免疫调控作用，作者构建了Lyz2cre/+Ahrfl/fl（AhR缺陷型）小鼠模型，发现在AhR缺陷的小鼠中CD45表达下降，MHCII, CD40 和PDL1表达增加，以及促癌基因（Arg1和Ido1）的表达下调和促炎基因（Il1b、Gzb和MHCII）表达上调，这些结果均表明AhR的免疫调控作用。此外，作者还发现在AhR缺陷的小鼠中CD8+ T细胞活化数量增加，而肿瘤的重量和浸润性癌的比例明显低于TAM，ROC曲线也表明AhR缺陷的小鼠具有更好的存活率。
图1 AhR缺陷驱动TAM和CD8+T细胞的炎症极化
2. AhR重塑PDAC中的转录景观
为了了解巨噬细胞中AhR功能对TME的影响，作者对肿瘤组织和AhR缺陷肿瘤组织进行了质谱流式和单细胞转录组分析，均鉴定出3个巨噬细胞簇。iGSEA富集分析表明AhR缺陷影响了包括干扰素响应通路，信号转导网络及免疫调节相关基因的表达，且PDAC TME中的巨噬细胞群体表现出具有前肿瘤、替代极化状态特征的转录谱。
图2 AhR重塑PDAC中的免疫转录景观
3.乳酸菌通过色氨酸代谢途径激活AhR
由于AhR是色氨酸代谢产生的受体，接下来，作者拟寻找在TME中驱动AhR活性的配体来源。前人的研究表明，乳酸菌能够通过色氨酸代谢产生吲哚，且乳酸菌是炎症性疾病骨髓细胞中AhR活性的重要驱动因素。于是作者使用乳酸菌不耐受的Amp和耐受的Vanc分别处理荷瘤小鼠，肠道微生物检测结果发现抗生素Amp降低了乳酸菌的相对丰度，且Amp抑制乳酸菌之后能够有效的提高MHCII和PD-L1的表达来提高免疫应答效果，从而抑制肿瘤的生长。该数据表明抗生素治疗、乳酸菌调节以及肿瘤内免疫调控之间潜在的联系。
通过质谱分析发现乳酸菌L. reuteri和L. murinus能产生吲哚类物质激活AhR，且L. murinus的产量更多。随后作者测试了L. murinus是否会影响PDAC中的肿瘤生长和炎症，在无菌小鼠肠道中移植L. murinus后研究其对肿瘤生长的影响，结果显示L. murinus不仅能够促进PDAC肿瘤生长，增加AhR活性，还能促进Arg1, Ido1, Il10等促癌基因的表达，这表明L. murinus可以驱动TAMs获得免疫抑制程序。
图3 乳酸菌驱动TME中的免疫抑制
4. 饮食影响肿瘤生长及免疫调控
由于色氨酸代谢是激活AhR的关键机制，作者测试了通过调整饮食去除色氨酸是否会影响肿瘤的生长。结果发现，去除色氨酸后肿瘤重量显著降低，而在饮食中加入吲哚之后，又能显著的增加肿瘤重量。这些数据表明，膳食色氨酸是PDAC TME中免疫表型的关键驱动因素。
图4 膳食中色氨酸和吲哚可促进免疫抑制和PDAC生长
5. AHR表达和活性与人胰腺导管腺癌的患者预后相关
随后，通过胰腺癌TCGA数据库分析发现，低表达AhR有利于生存，且PDAC TCGA队列中AhR表达特征与T细胞和巨噬细胞基因表达呈负相关。
图5 AhR的活性与人类PDAC患者的预后有关
小编小结
文章聚焦于肠道菌群对肿瘤的免疫调控，运用单细胞转录组技术联合肠道微生物，揭示了乳酸菌通过代谢食物中的色氨酸，激活肿瘤相关巨噬细胞，促进肿瘤生长的机制，为更个性化的癌症治疗指明了方向。
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