排查MiSeq的Best Focus和No Usable Signal及其它第一个循环报错原因
以及其它第一个循环报错的原因？
MiSeq™平台在第一个循环拍照时发生报错通常表明簇信号强度不够，仪器不能找到最佳的聚焦平面。
可能的报错信息包括：
· Best focus not found
· Best focus is too near the edge of range
· No usable signal found, it is possible clustering has failed
· Through-focus peak did not exceed SNR threshold
· Z Motor attempt to move outside soft limits
可能的仪器原因包括：
· 参与簇生成和第一个碱基化学反应试剂的液流问题
· 流动槽温控问题
· 光学系统问题（这种情况非常少）
可能的文库和试剂原因包括：
· 使用了过期或者储存条件不当的试剂
· 文库设计或者文库质量/定量问题
· 由于文库设计问题导致Read1引物杂交不好
· 使用了不合适的引物
· 簇密度过高或者过低
如果已明确是引物问题，而且机器可以联网，请直接和Techsupport联系或通过因美纳服务与支持公众号提交需求进行问题排查。
排查第一个循环报错原因
首先可以按照MiSeq™ System Guide对仪器进行系统检查，确保仪器的流路、温度以及机械移动系统正常运行：
1. 对仪器进行Post Run Wash（测序后清洗）
2. 按照使用手册，重启机器
3. 去Manage Instrument（管理仪器）界面，点击System Check（系统检查）
4. 选择所有的机械移动系统测试，润洗试剂流路，温度梯度以及流路测试
当系统检查完成，点击屏幕左下方的Show Details（展开细节）按钮，得到检查结果的完整信息。如果是PR2以外的任何流路测试或者其它测试失败，请发邮件到chinasupport@illumina.com或通过因美纳服务与支持公众号获得更多技术支持。
如果系统检查未显示测试失败，则要考虑报错可能是由文库或者试剂问题导致的。
我们需要分析以下常见问题：
· 检查试剂盒的有效日期以及正确储存条件
· 确保文库设计适合在Illumina平台测序
· 利用Illumina推荐的方法，检查文库质量和浓度
· 确保自定义引物适合MiSeq™平台65℃的退火温度
· 确保自定义引物加入到试剂盒正确的孔中（如果加入到已有引物的试剂孔中，sample sheet不需要修改，如果加入到自定义引物的试剂孔中，则Sample Sheet需要选择自定义引物）
如果文库或试剂没有明显问题，在文库中掺入20% PhiX重新测序。PhiX可以作为下一次测序簇生成的阳性对照，进而判断之前的错误是否是由文库问题导致的。
如果下一次测序第一个循环仍旧发生No Usable Signal和Best Focus报错，可以发邮件到Illumina技术支持邮箱chinasupport@illumina.com或通过因美纳服务与支持公众号获得更多技术支持。
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仅供研究使用，不得用于诊断
