骨发育的重要因子Mmp13基因与小鼠模型

赛业生物《每周一鼠》，每周五更新，为大家讲解一个小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Mmp13基因敲除小鼠。

Mmp13基因
MMP13属于基质金属蛋白酶家族，是一种胶原酶，该家族蛋白参与如胚胎发育、组织重塑等正常生理过程，还参与疾病过程中的细胞外基质分解。该蛋白的主要功能除了参与骨关节中的Col II降解外，还可以降解软骨中其他类型的胶原如IV型、IX型，和软骨基质成分蛋白多糖等。MMP13及其抑制剂（MMPIS）的失衡是导致Col II降解的起始因素，正常情况下，二者以1:1的比例存在于软骨细胞的胞外基质中，进而维持基质的相对平衡。
 

图1. Mmp13基因基本信息^【4】。

研究人员发现，MMP13在人类正常的组织中含量较低，而在骨关节炎患者中MMP13含量在结缔组织中有很高的表达量。MMP13表达下调会在一定范围内控制骨关节炎（Osteoarthritis，OA）发病进程；而MMP13转录水平一旦上调，软骨细胞内环境的稳态平衡就会遭到破坏，进而使疾病更加严重。除此之外，MMP13还与脊椎干骺端发育不良有关。与之相关的通路包括AGE/RAGE信号传导通路和激酶级联反应中的G蛋白信号传导GTP酶信号传导通路相关。GO分析显示该基因与钙离子结合活性和金属内肽酶活性相关。
 

图2. MMP13蛋白结构预测^【3】。

Mmp13敲除小鼠
纯合Mmp13敲除小鼠有肥大软骨细胞区的宽度增加以及小梁骨增加的表型

Stickens D等人为了评估骨骼中哪些细胞表达Mmp13，在软骨骨化过程的不同阶段对小鼠胫骨进行原位杂交。在胚胎期15天，Mmp13在肥大软骨细胞和原发性骨化中心新募集的骨细胞中表达（图3左）。在生长板建立后，Mmp13的表达仅限于肥大软骨细胞群末端和小梁成骨细胞（图3右）。
 

图3. Mmp13在骨化过程中的表达^【5】。

左图通过对胚胎期15天野生型小鼠胫骨的原位杂交检测Mmp13表达。Mmp13信号用红色表示。黄色虚线表示骨化前沿。蓝色表示Hoechst复染剂。在肥大软骨细胞群（HC）和原发性骨化中心（PO）中能观察到Mmp13表达，在增殖软骨细胞 （PC） 群中没有观察到Mmp13的表达。右图通过原位杂交检测1周龄野生型小鼠趾骨上的Mmp13表达。结果与在左图中观察到的表达模式相反，Mmp13表达仅限于肥大软骨细胞的最末端（箭头指示），TB代表小梁骨。

在软骨成骨过程中，MMP13的缺乏导致生长板结构改变和骨小梁增加

用茜素红和阿尔新蓝对Mmp13敲除小鼠的整个骨骼进行染色表明，与野生型同窝小鼠相比，所有骨骼无明显差异且长度基本相等（图4A）。因为胫骨和跖骨在生长板的闭合上存在较大差异，因此研究人员着重对其进行微观分析。跖骨大约在四周龄的时候生长板就会闭合，而在完全发育的胫骨中，会保留一小部分生长板软骨。在15日龄，跖骨和胫骨都能观察到骨化中心的形成（图4D），在这个阶段，有文献结果显示，Mmp13的mRNA在肥大软骨细胞中高表达，并与X型胶原蛋白共定位，Mmp13还会在向矿化软骨基质的成骨细胞中表达。

在该研究中，15日龄的Mmp13敲除和野生型小鼠的长骨之间没有明显的差异（图4B,C）。因此，在缺少Mmp13的情况下，软骨骨化的初始阶段似乎没有受到影响。研究人员还发现，在动物1周龄之前，Mmp13敲除小鼠跖骨的肥大区也变得明显（图4D,E）。这种表型的严重程度与骨骼的类型具有很高的相关性，通过比较可以发现，跖骨肥大区的扩张比胫骨更明显（图4F,G）。Mmp13敲除小鼠在出生后5周龄，表型都会随着骨生长而变得严重。5周后，骨生长速度减慢，同时肥大的软骨细胞群逐渐恢复到正常的数量。到12周龄时，生长板相关表型得到改善（图4H,I）。此外，研究人员发现，番红素O对突变的生长板具有更高的染色附着力，这表明，Mmp13有助于蛋白多糖的转换。
 

图4. Mmp13敲除小鼠中生长板缺陷的组织学检查^【5】。
（A）2周龄野生型和Mmp13敲除小鼠整体骨骼的茜素红/阿尔新蓝染色，结果显示不同基因型之间的整体骨骼结构没有明显差异。
（B, C）对胚胎期15天野生型和Mmp13敲除小鼠的胫骨进行染色，结果显示两种基因型的骨干中都存在矿化组织。在不同基因型中，增殖软骨细胞（PC）区、肥大软骨细胞（HC）区和原发性骨化中心（PO）都没有明显差异。
（D, E）10日龄野生型和Mmp13敲除小鼠的跖骨番红O染色结果
（F, G）10日龄野生型和Mmp13敲除小鼠的胫骨番红O染色结果。Mmp13敲除小鼠生长板的肥大软骨细胞（HC）区域扩大（黑条双箭头表示的长度）。
（H，I）12周龄的野生型和 Mmp13敲除小鼠的胫骨番红O染色结果。之前观察到的肥大软骨扩张表型得到改善，但番红O在突变小鼠生长板中附着力更强，TB代表小梁骨。

治疗方法
Mmp13敲除小鼠会有骨发育相关的问题，而人的Mmp13与OA具有很强的关联性。OA是临床上最常见的慢性关节疾病，OA对全球3.03亿患者造成病痛，患病率随着年龄增长逐渐增加，对中老年人的身体健康造成严重威胁。

OA 的治疗方式分为基础治疗、药物治疗和手术治疗，其中药物治疗是OA的重要治疗方法，广泛适用于中早期的OA患者，中老年患者易于接受。传统OA治疗药物有对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药、氨基葡萄糖和软骨素、糖皮质激素、透明质酸、透明质酸、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、医用几丁糖、双醋瑞因和富血小板血浆，大多以缓解症状为主。

新型OA药物包括白介素-1（IL-1）抑制剂、肿瘤坏死因子（TNF-α）抑制剂、成纤维细胞生长因子 18、β-神经生长因子、转化生长因子-β 抑制剂、Wnt 信号通路抑制剂、骨形态蛋白-7。