三代全长16S/18S/ITS扩增子测序的介绍
三代微生物多样性是基于PacBio SequelⅡ测序平台，利用单分子实时测序的方法，对原核生物16S的全部V1-V9可变区域或真核生物的18S高变区域或ITS区域进行全长扩增，不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更全面的反应微生物的群落结构。
一、PacBio测序原理
利用与二代测序相同的边合成边测序的原理，以SMRT芯片为载体；模板与特殊聚合酶结合后，4种不同荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）通过布朗运动随机进入检测区与聚合酶结合，按DNA模板序列延伸；通过检测单个DNA分子的合成所产生的信号来进行测序，也可通过检测相邻两个碱基的测序时间，来检测一些碱基修饰情况。
图1. PacBio测序原理[1]
二、产品优势于二代测序只能获取1~2个高变区短读长序列而言，三代测序能一次性测到所有高变区，同时也可以避免不同引物带来的偏好性，从而提高微生物群落的分类学分辨率。
1.更长读长，更高准确率[2]
图2. 测序长度和准确度
2.更高的物种鉴定分辨率和精确度[3]
图3. 物种鉴定结果
3.更准确的还原微生物群落[4]
图4. 微生物群落分布
三、技术路线
图5. 技术流程图
四、案例分享文章标题：三代全长微生物多样性研究母婴微生物群[5]
研究小结：早期微生物与成年后疾病的发生发展有一定的关系，研究发现子宫、胎便、羊水和胎盘都有微生物存在，那么婴儿胎便微生物来源与母体不同来源的样本的关系如何呢？本文以39对母婴的产妇样本（羊水、粪便、阴道分泌物和唾液）和婴儿胎便样品为研究对象，基于PacBio三代全长测序技术进行16S rRNA检测。检测发现不同类型样本间α多样性和β多样性存在特异性；同时除发现不同类型样本各自的一些优势菌（其中羊水和阴道分泌物的优势菌为Lactobacillus和Curvibacter，胎便的优势菌为Bacillus 和Escherichia/Shigella，产妇粪便的优势菌为Bacteroides和Faecalibacterium，产妇唾液的优势菌为Streptococcus和Prevotella）外，还发现了他们间共有OTUs，其中胎便菌群与羊水菌群的共有OTUs多于产妇粪便菌群和阴道菌群，由此推断羊水菌群相比其他位点贡献更大。此外，发现剖腹产和顺产胎儿的胎便和羊水微生物群落结构无显著差异。
图6. 文章部分结果
参考文献：
[1] Mohit K Midha, Mengchu Wu , Kuo-Ping Chiu. Long-read sequencing in deciphering human genetics to a greater depth. Hum Genet . 2019 Dec;138(11-12):1201-1215.[2]PacBio. 2022. PacBio Sequel Systems-PacBio.[online]Availableat: [Accessed 14 February 2022].
[3] Jethro S Johnson, et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun. 2019 Nov 6;10(1):5029.
[4] Esther Singer, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling. ISME J.2016 Aug;10(8):2020-32.
[5] Qiuwen He, et al. The meconium microbiota shares more features with the amniotic fluid microbiota than the maternal fecal and vaginal microbiota. Gut Microbes. 2020 Nov 9;12(1):1794266.
文献下载链接：
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标签：
代谢组学
