ACE2人源化小鼠助力新冠病毒研究

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19大流行在全球范围内已造成超过3.3亿例感染。SARS-CoV-2刺突（Spike）蛋白在功能上不仅负责识别宿主细胞上的受体，同时还会介导细胞膜与病毒包膜融合，从而导致病毒感染宿主细胞。

目前全球流行的突变株在刺突蛋白上有多处突变发生，给疫苗的更新和设计都带来了极大挑战。SARS-CoV-2的 S蛋白单体包含两个片段：氨基末端的S1亚基中包含一个受体结合域(RBD)，它能够识别宿主ACE2受体并进行相互作用；而羧基末端S2亚基催化病毒和细胞膜的融合，推动之后病毒RNA释放进入细胞，并在受感染细胞内进行复制的生物学过程，对病毒感染机制的研究是遏制当前大流行和预防未来冠状病毒爆发的一个研究重点。虽然目前已经发现宿主血管紧张素转换酶2（ACE2）蛋白能与病毒刺突蛋白结合，但结合后的分子机制还不明了。

北京时间2021年12月21号，发表在综合性国际学术顶级期刊《PNAS》上的一项研究中，中国科学院上海巴斯德研究所孟广勋组和Dimitri Lavillette组揭示了病毒感染过程中S2’片段的产生以及该片段在病毒和受体之间的识别、膜融合等过程中发挥的作用。
 

技术路线
病毒的刺突蛋白能和ACE2相结合。在这项新研究中，研究人员通过细胞-细胞融合技术以及敲入人ACE2的小鼠中分离出来的各种细胞系和原代细胞来研究ACE2蛋白对于感染过程的重要性以及刺突上关键氨基酸对于蛋白水解的必要性。他们发现在ACE2能促进病毒刺突水解产生S2’片段，这种关键性的水解作用对刺突介导的膜融合非常重要。
 

图1. 本项研究中，作者通过体外细胞-细胞融合系统，分别在不同细胞中表达S蛋白、与有无ACE2受体的细胞共同培养，并且检测了S蛋白在融合过程中的酶切反应、细胞膜融合与感染机制。

在ACE2蛋白存在的情况下，刺突驱动的合胞体形成会伴随着S2’片段的形成

为了探究刺突 (S) 蛋白在活细胞中与其受体ACE2结合后的功能和生化特征，研究人员利用细胞-细胞融合试验从合胞体中获得可能切割的刺突蛋白产物。

通过将HEK293T-ACE2细胞和表达刺突的HEK293T细胞共培养再对合胞体进行裂解，以及免疫学实验。研究人员检测到了约68 kDa S2’的条带 ，而对照组细胞只表达刺突蛋白并不存在S2’条带。除此之外，S2’条带的亮度还取决于加入的 ACE2 表达细胞的数量，表明ACE2的增加促进了刺突蛋白的蛋白水解加工。
 

图2. ACE2蛋白介导的刺突驱动的合胞体的形成会伴随S2’片段的形成。

S2’位点的切割需要功能性的ACE2蛋白特异性的识别作用

之前的研究已经证明，鼠源表达ACE2的细胞对于野生型SARS-CoV-2刺突介导的感染具有抵抗性，因此，研究人员探究了人和小鼠ACE2变体产生的S2’片段是否具有相同的作用。

为了验证这个假设，研究人员设计了Co-IP实验验证不同种属ACE2蛋白的差异性。

研究人员发现，小鼠ACE2不能和刺突的RBD结构域结合，而人ACE2蛋白可以；不仅如此，人的ACE2蛋白能和全长的刺突互作，但是小鼠的蛋白无法互作。

研究人员为了在原代细胞中模拟刺突驱动的合胞体的形成，委托赛业生物构建了人源ACE2基因敲入小鼠（H11位点），并且分离得到了敲入小鼠肺上皮细胞。该品系小鼠携带“K18 promoter-Kozak-human ACE2 CDS-P2A-CreERT2-rBGpA”cassette，既表达人源的ACE2受体，又有CreERt2，可用于研究特定宿主基因（floxed）在应答新冠病毒感染中的作用。不仅如此，研究人员检测到了S2’条带，还观察到了合胞体形成的绿色荧光信号。

图3. 特异性的ACE2蛋白识别水解并产生S2’片段。

刺突815位精氨酸位点是S2’切割所必须的

已知SARS-CoV-2刺突蛋白可以在多个位置被切割，特别是S1/S2连接点(685)或S2’位点 (815) 处的精氨酸。研究人员为了研究其功能，研究人员将这两个位置的精氨酸突变为丙氨酸。

实验结果显示，HEK293T细胞表达的包含R815A突变的刺突导致蛋白无法水解出S2’，因此刺突上的815位点的精氨酸是S2’水解所必须的。

图4. 刺突蛋白第815位的精氨酸是水解产生S2’所必须的

小结
以上实验证明了刺突蛋白参与病毒感染过程中，水解形成S2’蛋白的反应是新冠病毒感染过程中不可或缺的分子事件之一，其中的815位点的精氨酸更是水解切割所必须的。