定量磷酸化蛋白质组学揭示循环拉伸下肺细胞的排列和线粒体长度变化

循环拉伸是一种可以在贴壁细胞中研究的过程，这些细胞接种在柔性表面上，然后周期性地进行拉伸。这一过程创造了一个动态环境，模拟不断收缩的器官，如肺、心脏和肌肉组织。多项研究表明，拉伸会激活信号通路。例如，拉伸的肌肉细胞会激活 Nox4 信号通路，并增强核蛋白导入。
 

磷酸化是细胞的一个重要方面。例如，表皮生长因子受体 (EGFR)（质膜上的一种酪氨酸激酶受体）的体细胞突变会导致自身磷酸化和组成型激活，从而导致癌症中细胞分裂。刺激诱导的信号改变背后的蛋白质磷酸化的特性可能为细胞中生理事件的调节提供重要的见解。近年来，磷酸化蛋白质组学定量分析的最新进展使研究人员能够研究信号通路的异常调控。
 

肺癌是导致死亡的主要原因。大多数以前的研究都是基于传统的细胞培养方法。然而，肺细胞在呼吸过程中会周期性地受到机械力的影响。因此，了解肺细胞中诱导的循环拉伸的潜在机制可能对肺癌治疗很重要。

基于此，台湾中央研究院与国立台湾大学基因体与系统生物学的学位项目进行了相关研究，首先应用磷酸蛋白质组学技术来分析人 A549 肺癌细胞和 IMR-90 肺成纤维细胞中拉伸诱导的磷酸蛋白质组。此外，使用生物信息学工具和统计方法分析了不同的磷酸化蛋白质组学状态，从而揭示了拉伸诱导的生物功能。
 

在这项研究中，对两个细胞系应用了短期（15、30 和 60 分钟）和长期（24 小时）的拉伸。循环拉伸实验采用 10% 的 CSA 变化和单轴拉伸方向。对收集的蛋白质进行消化和加工，然后使用 TiO2 进行磷酸肽的富集，通过质谱法分析磷酸肽。使用 MaxQuant 软件对磷酸化蛋白质组数据进行量化和鉴定。最后对拉伸诱导的基因组和磷酸化蛋白质组差异表达基因/蛋白质进行了功能富集。

图1  循环拉伸诱导的磷酸化蛋白质组学分析的实验步骤和工作流程
 

一些磷酸位点在两种细胞系中都表现出对拉伸的敏感性，例如 SEPT9 Ser30 和 Zyxin Ser281。SEPT9 Ser30 的磷酸化促进了 HeLa 细胞中的细胞粘附。先前的研究表明，拉伸会破坏紧密的连接和粘附。SEPT9 Ser30 在 IMR-90 和 A549 细胞中均上调。因此，该实验认为这种磷酸化有助于细胞对拉伸的反应。
 

同样，磷酸化的 Zyxin Ser281 与 CDK8 相互作用，从而激活 YAP 介导的有丝分裂。该磷酸位点在两种细胞系中均显示下调。其他磷位点显示出不同程度的改性。据报道，AKT1S1S Ser203 磷酸位点可激活 mTORC 信号通路，从而增强致癌性生长。该磷酸位点在 A549 癌细胞中上调，但在 IMR-90 成纤维细胞中下调。

在功能网络分析中，发现 A549 和 IMR-90 细胞均富集细胞骨架组织和细胞成分组织。为了深入了解循环拉伸诱导的生物学功能，应用了聚类分析发现，细胞-细胞粘附功能显示两种细胞系中六个簇的显著富集。然后进一步研究了循环拉伸后是否会发生细胞运动，随后观察到循环拉伸后的细胞重排。在血管内皮细胞和成纤维细胞中也发现了这种现象。

细胞重排是由机械拉伸诱导的，这种拉伸经常发生在各种细胞类型中，有趣的是，在研究中使用的 A549 和 IMR-90 细胞系中也观察到了这种现象。细胞重新定向是对循环拉伸的常见反应，与此一致，在涉及丝状聚合和合成的蛋白质（包括肌动蛋白丝、肌球蛋白和微管）上发现了几个显著改变的磷酸位点。研究人员认为这些磷蛋白可能与循环拉伸诱导的细胞重排有关。

此外，实验发现线粒体和高尔基体的转运及其生物合成是功能富集的结果。结合拉伸诱导的基因表达和功能注释，发现与线粒体组织相关的功能是通过循环拉伸调控的。该实验数据表明，30 分钟和 24 小时的拉伸可以延长线粒体长度，这可能与 IMR-90 和 A549 细胞的线粒体动力学有关。

图2  循环拉伸作用下被显著调控的必需蛋白中几个磷酸位点可能参与的特定生物学功能。
 

A 微管相关蛋白1B（MAP1B）和谷氨酸受体相互作用蛋白1（GRIP1）之间的相互作用可以减慢线粒体运动。
B 肌球蛋白参与线粒体断裂。
C 表皮生长因子受体 (EGFR) 信号的激活增强了肌球蛋白 IIA 的活性。
D 在两种细胞系中，通过循环拉伸激活了几种粘着斑相关蛋白。粘着斑活性的变化导致细胞重排。

在该研究中，磷酸化蛋白质组数据揭示了响应循环拉伸的细胞类型特异性和常见磷酸化位点。此外，证明了细胞重排是细胞抵抗持续拉伸的一种策略，并表明细胞拉伸可增加线粒体长度。总之，周期性循环拉伸引起的磷酸化水平变化可能为动态细胞拉伸提供新的视角。

参考文献：Wang WH, Hsu CL, Huang HC, Juan HF. Quantitative Phosphoproteomics Reveals Cell Alignment and Mitochondrial Length Change under Cyclic Stretching in Lung Cells. Int J Mol Sci. 2020 Jun 7;21(11):4074. doi: 10.3390/ijms21114074. PMID: 32517296; PMCID: PMC7312583.
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