Vero细胞在生物反应器中传代扩增的培养方法及工艺流程

Vero细胞是基因工程常用细胞的一种，使用生物反应器进行Vero细胞规模化扩增培养是基因制药的关键工艺。

一、Vero一次传代细胞培养
1. Vero细胞洗脱和收集：
购买回来的Vero细胞的一般采用悬浮培养的方式在培养瓶中进行接种培养。当细胞增殖到传代数量时可用DPBS缓冲液进行洗涤，经过两次充分稀释后再用从培养瓶中收集细胞。
2. 转瓶扩增：
用于Vero细胞增殖的培养基的主要成分有：含胎牛血清、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、抗真菌抗生素等成分的DMEM。根据产物的不同所使用的微载体也不相同，由于Hillex®微载体具有阳离子胺改性微孔表面可以在不影响细胞收获效率的情况下提高细胞吸引和附着性的特点，所以在Vero细胞改造中被广泛使用。传统Hillex® II微载体制备，需在121℃的去离子水中进行高压灭菌30分钟左右。细胞接种在微载体中的参考密度为18-19个细胞/载体。培养条件为恒温37°C;培养箱内二氧化碳浓度以5%左右为宜。

二、Vero二次传代细胞培养
当细胞在转瓶中的培养密度达到指定扩培值后，按实验要求向转瓶中添加一定量的DPBS进行微载体清洗，这个步骤需要注意的是不要讲DPBS溶液直接倒在微载体上以防细胞脱附。清洗2-3次后，倒出清洗液，加入胰蛋白酶溶液消化10分钟左右即可形成单细胞悬浮液。此时可以用来进行细胞计数、细胞存活率统计。当细胞密度和存活率达到指定标准值，即可转入5L的微载体培养生物反应器中进行进行二次传代培养。微载体生物反应器经高压灭菌后，加入培养基。在添加细胞之前，培养基的pH值参数为7.2左右，调至7.2，DO值的设定以空气饱和度的30%左右为宜。转速设置在60 rpm左右；细胞添加期间，搅拌速率需增加至70 rpm，加入细胞后恢复为60 rpm。在微载体培养过程中通过气体控制及通氧量来控制DO值。

从培养第2天起需要每天向生物反应器内批量灌注培养基及营养液，以补充养分消耗。

每天从取样口处取样采集，通过细胞计数法来分析细胞密度。正常培养下，5天左右即可达到指定扩增值。当细胞密度达到收获值时，即可转入下一个阶段的扩增生产。

三、Vero三次传代细胞培养
通过取样测定检测，当细胞达到指定的收获密度时，即可关闭搅拌器停止搅拌，使微载体沉降，此时吸取上层的培养液，缓慢加入DPBS缓冲液进行细胞清洗，收获细胞。

三次细胞传代可选用15L的大容量生物反应器进行细胞扩增。扩增培养过程与二次传代工艺流程相同，只是每个阶段的DO值、pH值、搅拌桨转速等参数设置会有不同，需要参考生物反应器的标准作业相关规定进行操作。当细胞生长密度达到指定值时进入下一阶段生产。

从以上步骤我们可以看出生物反应器在进行抗体蛋白的生产、基因制药和浓缩方面都具有着不可替代的作用。通过生物反应器进行载体培养技术可实现疫苗产品的GMP规模化生产需求。