定量PCR操作过程中的注意事项

在定量PCR（也称rt-PCR或qPCR）中，荧光信号是由荧光探针或荧光DNA结合染料（如SYBR Green）产生，其强度与PCR产物分子（扩增子）的数量成正比。每个循环结束时，收集荧光信号强度，通过将荧光强度与循环数作图，qPCR仪生成扩增曲线，其表示在整个PCR过程中产物的累积，通过这个过程，即可实现量化。如果样品中特定的序列（DNA或RNA）丰富，则在较早的循环中观察到扩增，Ct值小;如果序列稀少，则在稍后的循环中观察到扩增，Ct值大。此SOP将涵盖总RNA提取和两步法逆转录定量PCR（qRT PCR）的操作过程以及数据分析。
    
 注意事项：
1. 所有步骤均应在超净工作台上进行，超净台紫外照射至少15min。
2. 所有试剂应为此实验专用。
3. 使用75％乙醇或其他去污剂擦拭工作台，避免表面污染。
4. 进入荧光定量PCR 操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR 模板污染。
5. 实验中使用各种规格的离心管，枪头及配制试剂和溶解沉淀用的水，均应焦碳酸二乙酯（DEPC）处理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。
6. 使用Trizol试剂时，避免接触皮肤或衣服。避免吸入蒸气。
7. qPCR反应需要qPCR级水，试剂和试管。请务必使用正确类型的qPCR光学PCR管和盖子。不可用普通的PCR管。
8. 加样前，先布局，规划加样顺序以避免交叉污染。
9. 所有实验应均应设置无模板对照，其中包含除DNA或cDNA样品以外的所有反应组分。
10. 先配制qPCR反应混合液，减少误差。
11. 加样后上机前，务必通过瞬离将反应液离至管底，并消除溶液中的气泡，因为气泡会干扰荧光检测且降低酶活性，从而降低扩增效率。