从试剂到定量：抗体内化一站式分析方案
单克隆抗体目前被广泛用于抗癌、抗炎和抗病毒治疗。抗体的一个重要特性是细胞内化的程度、位置和速度。抗体偶联药物（ADC）的作用机制是向细胞内输入细胞毒性物质引起细胞毒性杀死肿瘤细胞，其特异性和细胞的摄取程度对ADC的有效性和安全性至关重要。
因此，了解抗体在细胞内的内化，并能够比较不同抗体的摄取情况，是生物药物发现抗体选择和优化的关键要求。
检测和筛选抗体内化的传统方法在应用上仍然存在一些短板：
|
1 |
采用终点式检测，每次检测只能获得一个时间点的结果，无动态数据 |
|
2 |
检测时因缺少环境控制而导致细胞变化 |
|
3 |
需多平台联合使用，才能准确定量 |
|
4 |
无法实时观察到内化动态过程 |
|
5 |
无法满足高通量筛选需求 |
Incucyte可提供从试剂到定量分析的一整套，抗体内化实时观察和定量的解决方案。
图1.Incucyte抗体内化实验方案
Incucyte抗体内化的主要优势
一步法抗体标记试剂，无需清洗和优化
图2.FabFluor抗体标记试剂检测原理
- Incucyte FabFluor抗体标记试剂是一个与pH敏感的荧光探针结合的Fc区域靶向Fab片段，与抗体的Fc端结合形成Fab-Ab复合物；
- 在常规培养基中（pH 7.0）,Fab-Ab没有荧光或荧光很微弱，内化后其环境pH降低（pH4.7—6.3），Fab-Ab发出明亮的红色荧光；
- 使用简单快速，常温孵育15min即可，无需清洗和优化。
实时观察，评估抗体内化的时间依赖性变化
图3.Incucyte FabFluor标记的α-CD71抗体内化到HT1080细胞的动态分析。HT1080细胞分别用FabFluor标记的α-CD71和IgG处理，用Incucyte10X镜头，相差成像和红色荧光成像，拍照间隔15min，共计12h。与同型对照IgG(B)对比，α-CD71标记的实验组（A）有明显的红色荧光，表明该抗体能内化到HT1080细胞内；（C）Incucyte软件定量曲线，抗体内化随时间逐步增加。
抗体内化的药理学动态定量分析
图4. 不同浓度的Herception内化到BT-474 Her2阳性乳腺癌细胞的动态分析及剂量反应曲线。(A)不同浓度的Herceptin-Fabfluor，其内化成浓度依赖性上升；(B)曲线下面积计算，显示内化呈浓度依赖性上升，并得到EC50为426ng/ml。
可用于抗体的高通量筛选，提高工作效率
图5. 6种抗体8个浓度梯度经Fabfluor标记后内化到HT1080细胞。AB1a,AB1b,AB2这3种抗体在低浓度时即有内化现象；AB3,AB4,AB5只在高浓度时才会发生内化现象。
Incucyte可用于96孔板多种抗体多种浓度的同时筛选，也可扩大到384孔板，大大提高工作效率。
活细胞成像系统及相关抗体内化试剂为直接研究抗体在细胞内的内化提供了一个简单、集成和定量的解决方案，该解决方案可以很容易地同时比较多种抗体。这种方法使抗体内在化测量能够在生物制剂发现过程的早期阶段实施，并对新型治疗性抗体的有效性、安全性和药代动力学优化有价值。此外，该方法也适用于理解内吞作用、胞饮作用的基本机制。
扫描下方二维码，下载白皮书
