说说凝胶电泳
《说说凝胶电泳》
1807年莫斯科大学教授F. F. Reuss观察到黏土悬浮颗粒在两个电极间缓慢迁移的现象；100年后该现象被称为Electrophoresis 即电泳*。1937年瑞典化学家Arne Tiselius用他发明的自由电泳装置对动物血清进行了一系列电泳实验；依据不同区段折射率的差异，他判断出马血清里含有几种迁移率不同的蛋白质成分。上述成就使得他获得了1948年的的诺贝尔化学奖。后来人们意识到，只有在某种支持介质中进行电泳，才能够得到被电泳分离开的不同成分。早先人们采用滤纸和土豆泥等来作为电泳分离的载体。后来才找到了从海藻里提取的“琼脂糖凝胶”和化学合成的“聚丙烯酰胺凝胶”来作为生物大分子电泳分离的载体。前者是一种热容性凝胶，只要将其热溶液平铺在水平电泳池（槽）的平床上，待冷却到室温后它自然就形成琼脂糖凝胶片了。由于水平电泳池毫无设计难点；所以本文只讨论垂直片式凝胶电泳装置。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺的单/双体聚合而形成的一种网格状的凝胶。氧气阻碍丙烯酰胺类的聚合反应，因此该凝胶必须在密闭的腔体中才能够形成。早先人们只能够让它在玻璃管中形成柱状凝胶，并且进行电泳实验；后来人们才学会了让它在垂直的玻璃灌胶夹“vertical glass gel clips”里形成凝胶片，和进行电泳实验。于是，如何才能作到不漏地往玻璃灌胶夹中灌胶？以及如何才能够让灌了凝胶的玻璃灌胶夹的上开口与上缓冲液容器（UBC）不漏地连通？这两个问题就成为贯穿在垂直片式凝胶电泳术中的两个大难题了。
大型垂直片式凝胶电泳是英国生物化学家Frederick Sanger团队开发出来的一种电泳技术。其灌胶夹和X光胸透底片一样大小，由两片超平的玻璃板和两条极薄的侧位垫条(spacer)构成。由于很难封堵其下开口，因此它往往是斜躺着进行灌胶，靠液体的表面张力来把凝胶形成液维系在两片玻璃板之间而聚合成聚丙烯酰胺凝胶片的。跑电泳时它无需冷却，反而要提高电压产生热量好让DNA的片段们在热变性状态中进行电泳分离。由于大凝胶片的中部散热不良，而使得“电泳分离的等高线”出现微笑形弯曲的现象，严重时会导致碱基顺序的误读。后来的解决办法是：在大灌胶夹的后面衬上一块导热性极佳的镁板来拉近各处的温度（请参阅US 5885433）。既由于大型者的电泳距离相当长，也由于其放射性标记的样品的加样量极少，而使得大型电泳能够达到很高的电泳分辨率；表现为电泳后放射显影的底片上一次可以读出DNA中上百位的碱基顺序来。这种大型垂直片式凝胶电泳技术是Sanger博士的“双脱氧核苷酸终止法测定DNA碱基顺序技术”的最后、最关键的一步；它在它的主人于1980年获得第二个诺贝尔化学奖中作出了重要的贡献。不过十多年后，这种大型垂直片式凝胶电泳装置和技术，就逐渐被一些“自动化的毛细管凝胶电泳仪”所取代了。
至今还在阿里巴巴上热卖的那种“夹芯式垂直片式凝胶电泳池”是40多年前本人在中国科学院北京动物研究所时的发明。它是世界上三种流行开来的中型凝胶电泳装置中最早、也是最好的一种。它达到的指标包括：灌胶夹16 cm平方，其凝胶片的两侧都能够得到冷却；其全部拆装只需拧动4条螺栓；而且它是第一种能够在电泳池中进行“原位灌胶”的电泳装置。直到2002年美国的Owl公司才把咱们中国人使用了20多年的“用琼脂糖凝胶在电泳池中原位封堵灌胶夹下开口的技术”写进了他们的US 6924775专利里；请参看该专利的摘要部分。
夹心式电泳池
可惜，那年头中国还没有专利法。动物研究所拖到1979年才为我的该项发明开了一次成果鉴定会；我留有一台样机作为纪念品至今。该发明流出後，使得近水楼台的北京某仪器厂很快就因为将之批量投产的获利，而把他们自己给做大了。扩大的产量满足了中国科研方面40多年来的需要。可惜厂家把心思用在省工减料上了；至今也没有见到有一台“夹芯式电泳池”被销售到其它国家去。
美国Hoefer公司在1980获得了他们的US 4224134中型凝胶电泳池专利。虽然该电泳池使用起来很不方便（每次拆装都要拧24个螺栓和8次偏心旋扭）但是它却相当可靠；因而满足了美、欧各国几十年来需求的大部分。而另外一种流行开来的中型电泳装置就是Bio-Rad 公司的US 4574040专利的中型电泳池了。
1984年 Peter Hoefer 老先生在他的US 4560459专利里设计了一种 “一个侧壁上开有U-形上缺口的小型玻璃灌胶夹”（简称Hoeffer式的灌胶夹）。该小小的发明一下子就解决了灌胶夹的上开口和上缓冲液容器（UBC）连通的难题（后来在买到了该公司的专利产品后，我们才知道Hoefer式灌胶夹里的那片带U-形上缺口的侧壁原来是用陶瓷片做的）。自从Peter发明了那种带有U形上缺口的小型灌胶夹以后，人们只要能够想出办法来用两只那样的灌胶夹去充当某个上缓冲液槽（UBC）所缺失的那一对侧壁，于是一个“UBC/灌胶夹的复合体”就形成了；而且同时也就解决了“灌胶夹的上开口与UBC不漏地连通的难题”了。可以说，至今所有传统式小型垂直片式电泳池的“主体构件”都是以这样的方式构成的；当然，其中还需要有“U形橡胶密封条”和某种驱使机构（Urging mechanism）的参与才行。Hoefer公司早期出品，至今还在出售的ES250小型电泳池是用4个弹簧夹子来把两个灌胶夹安装到UBC上去的。该安装方式的优点是：弹簧夹子可以把不同厚度的灌胶夹安装到UBC上去（行话叫作“有兼容性”）。但是那样的夹子是没有法子夹到灌胶夹的底边上去，于是那里就会漏（记得当年我们往往要用吸管来吸取一两次下缓冲液，把它补充到UBC里去，否则电泳就会中途停止）。由此可见，灌胶夹的左、右、底3个边都必须直接受到驱使机构的挤压，才能够做到不漏地与UBC的靠接。
不知道是不是为了要绕开Hoefer公司上述专利里的发明点？或者也是为了要降低造价（在那个年代都是要用钻石刀具来在玻璃片上挖出所需要的U形上缺口的，且其废品率高达80%以上）而使得Bio-Rad公司没有采用“Hoeffer式的灌胶夹”，而是采用“一高一矮的两片玻璃壁”来构成他们的玻璃灌胶夹（简称Bio-Radr式的灌胶夹）的。可惜那样一来，在Bio-Rad公司出品的所有的垂直片式电泳池里，其灌胶夹和UBC的靠接面上就都出现了一个台阶了；其情况请参见Bio-Rad的US 4574040；US 4954236 和US 5632877等专利。而常识告诉我们，带有台阶的靠接面往往会漏；而且漏缓冲液的地方也就会漏电。
Hoefer公司所开创的Mini gel cassettes是4英寸宽，也就是10厘米宽。后来各公司都约定成俗，大家都采用了这同一的宽度。而小型灌胶夹的高度则通常是8至9厘米高；并且通常在其某个侧壁上是开有一个U形上缺口的。由于多数公司都采用两片1.5毫米厚的玻璃壁来构成他们的灌胶夹，因此Mini glass gel clip的典型厚度是4毫米厚（1.5 + 1 + 1.5 = 4）。与后来兴起的塑料灌胶夹相比，玻璃灌胶夹的优点包括：它们和凝胶的亲和性好，它们的刚性、透明度和导热性也都好；而且玻璃管胶夹是可以反复使用的。不过，采用玻璃灌胶夹的最大的缺点是：谁要是想作到不漏地往玻璃灌胶夹中灌胶，那可是一件大费周章的事。
由于小型电泳池们能够承担原来由中型电泳池所承担的大部分实验，所以小型池就逐渐取代了中型电泳池的地位，早已经成为此类仪器中的主角了。此外，小型电泳池之所以能够流行起来，那是和“不连续系统凝胶电泳技术”的发明分不开的。该技术早在“玻璃管凝胶电泳术”的时期就有了。其大体情况是：在分离凝胶上面铺设一层大网孔的堆积凝胶“stacking gel”；样品加在堆积凝胶上面；通电后，由于那6~7毫米高的样品层受到上缓冲液电泳行为的推挤，而被逐步向下压缩，最终堆积在堆积凝胶的底部而形成薄薄的一层，然后才进入分离凝胶开始进行电泳分离的（由于样品缓冲液是染色的，所以其样品层被压缩和堆积的全过程是可见的）。请设想：如果没有不连续凝胶电泳技术的采用，而是让6~7毫米高的样品层中的各种成分拖拖拉拉地先后进入分离凝胶进行电泳的话；那么又怎么能够指望在仅仅只有6~7厘米高的分离凝胶层中，样品中的不同成分就能够彼此分离开来呢？关于不连续凝胶电泳技术的原理，请参见有关的文献。
早先，凡是要跑电泳的人，都必须首先自己往灌胶夹里灌胶；而玻璃灌胶夹的底部和两侧则处处会漏。1997年美国Novex公司开始采用机器来成批地进行灌胶了。他们让不同参数的聚丙烯酰胺凝胶片在一个个Disposable plastic gel clip**里形成；然后再把他们的Precast gel“预灌胶”们出售给用户们去跑电泳。其一次性灌胶夹的宽、高都是4英寸，内腔间隔1毫米，外部轮廓7毫米厚；其下开口开在其U形上缺口对面离底边1厘米处，而且贴有封条。Novex 公司明白：他们开创的预灌胶片是不可能安装到当时任何品牌的电泳池里去跑电泳的。所以他们同时配套出品了自己的US 6001233专利电泳池；而且为之大打广告。经过几年艰苦的营销以后，Novex的预灌胶片在美国开始流行起来成为一种“电泳耗材”了。于是 Bio-Rad 等其他公司就坐不住了，他们也要出品他们自己系列的预灌胶了（老资格的Hoefer公司例外，该公司是由一些机械工程师组成的，他们不太精通化学）。而所有其它跟进的公司所出品的预灌胶，其塑料外壳的总厚度都必须尽可能地向4毫米厚的玻璃灌胶夹的厚度靠拢；否则岂不是就不可能安装到他们自己的电泳池里去了吗？那样一来，在美国市场上就形成了：外壳厚度是7毫米，或者是4点几毫米的两大系列塑料壳的预灌胶片了。它们和对方所出品的电泳池是不兼容的。
后来不太久，Novex公司就开始把他们的那种一次性的塑料灌胶夹的空壳也出售给用户们，由他们自己去灌胶了。如今美国的情况大体上是：购买现成的预灌胶者和购买其空壳者，各占一半吧。但凡是要用梯度凝胶片来跑电泳者，还是一律要向公司去购买现成的梯度凝胶片的，因为自己灌注梯度凝胶十分困难（请参见US 5597480）。
近年来在Novex 公司出品的那类7毫米厚的塑料灌胶夹上，都采用了一种“楔形齿的加样梳”了（请参见US D719277）。那样一来，在凝胶片上端形成的那一排“楔形的加样穴”里就能够容纳较大体积的电泳样品了（中国南京金斯瑞生物科技公司的US 9061236专利里的那种“上厚下薄的加样梳”也有类似的效果）。此情况对于那些浓度偏低的样品进行电泳，十分有利。否则无论是电泳前去一一浓缩样品，或是电泳后采用“银染”来补救；两者都十分麻烦。
我以为在中国，只有当厂家先出品了某种有兼容能力的电泳池以后，才会有公司愿意另外也出品一种较厚的、配有楔形齿加样梳的预灌胶以及它们的空壳。然后用户们才有机会有：采用塑料灌胶夹来方便进行灌胶并且跑电泳，或者干脆购买不同厚度的预灌胶来跑电泳等，4种选择。
退休以后我设计了三种不同的小型垂直薄片凝胶电泳池，它们是US 7749367；US 8808520；US 10145817以及CN 106404872。在我设计它们时，美国市场上已经有了厚度不同的小型垂直片式预灌胶了。我既不想自成体系，也不自恋，更没有闭门造车；所以我设计出来的那3种小型电泳池，它们和美国市场上所有那些厚度不同的小型垂直片式灌胶夹或预灌胶们都是能够兼容的。
大体上说，中国Lab里至今所使用的小型电泳池，还是以所谓的“仿伯乐电泳池”为主。当然采用的但是Bio-Rad式的玻璃灌胶夹。可是各个出品仿伯乐电泳池的公司如果愿意，大概只要花上￥10元/一片的代价，就可以外包请厂家用他们的“高压水刀”在你们小小的玻璃片上来各自切出一个漂亮的U形上缺口了。此外，只要用“挤出法”来生产出一批“剖面为8字形的硅橡胶软管”就可以把那些“带有台阶的U-形橡胶密封条”替换掉l。然后你们库房里的那些仿Bio-Rad US 5632877专利的电泳池就变成了“超伯乐型电泳池”了。
但是，如果你们当中有哪几家公司是抄袭了Bio-Rad的US 6436262专利的；那么你们的那种“仿伯乐次品电泳池”里的毛病是改不掉的。因为那里根本就没有任何真正的挤压机构；而是两个“卡子”去把两个灌胶夹“硬卡在UBC上的”。那两个灌胶夹的底部没有受到挤压力，那里当然就会漏。特别是当用户们采用刚性很差的塑料壳的预灌胶来跑电泳时，更是如此。其检测的办法是：把两两只买来的塑料壳的预灌胶片，反向地安装在你们的那种仿伯乐次品的电泳池的UBC上；再向所形成的“UBC/灌胶夹的复合体”中灌满电泳缓冲液；然后把它们坐放在滤纸上；一分钟就见分晓了。毛病出在它的主体部件上；那是改不掉的。
如今中国已经有十来家公司在出品不同参数全套的小型垂直片式预灌胶了。而且预灌胶在中国也开始成为“电泳耗材”了。我以为中国的有关公司们应该把心思用在开发出几种“具有兼容能力的小型垂直片式凝胶电泳池”上。撇开上述本人设计的那三种电泳池不谈；咱们是不是可以考虑把台湾同胞设计的US 7276143专利的电泳池拿来改造一番？其本来的设计既是可以进行原位灌胶的，也是可以采用不同厚度的灌胶夹的。但是，它那里的夹紧机构根本就夹不紧！至于如何才能改掉其夹不紧的毛病？欢迎彼此隔空讨论。
一旦有了能够采用不同厚度灌胶夹的电泳池，咱们再向出品预灌胶的公司去订购一批那种类似Novex较厚的预灌胶的空壳，并且配上那种楔形齿的加样梳；作为附件或赠品与咱们的新型电泳池一起出售给用户们去试用。我看这样一来一下子就能够在中国打开局面了。于是今后中国的情景将是：用户们不忙时可以继续使用玻璃灌胶夹自行灌胶并且跑电泳，比较忙时可以改用灌胶方便的塑料灌胶夹来灌胶和跑电泳；更忙时干脆安装上现成的预灌胶片来跑电泳。（连美国都没有出现过具有兼容能力的电泳池。那里所流行的电泳池只能够采用Novex公司那种厚壳的预灌胶来跑电泳。因此美国用户们已经把手里的玻璃灌胶夹都丢弃了）。
往往会因为彼此对电泳装置各方面的称呼不同，而带来讨论上的困难。那么请看：咱们所说的电泳是不是在“垂直片式灌胶夹”里所形成的“凝胶片”中进行的？与该灌胶夹上开口连通的那个容器是不是应该称之为“上缓冲液槽”？其中的电极是不是应该称之为“上电极”？是不是反之亦然？而那些用来在凝胶片上端形成一排“加样穴”的小器具，是不是应该称之为“加样梳”？是不是只有当咱们把“电泳槽”和“电泳电源”相提并论时，才能够将它们一起称为“电泳仪”？否则它们两者应该分别称为“电泳槽”或者“电泳电源”而已。
《小型垂直片式凝胶电泳池的升级换代》
小型垂直片式凝胶电泳池（以下简称电泳池）的升级换代在美国的Lab里已经进行了十来年了。绝大多数的那些流行了二、三十年的名牌“传统式的电泳池”（其中两个灌胶夹是面对面安排的；请参见US 5632877 和US 6001233等）已经被一种“非传统式的凝胶电泳池”（其中两个灌胶夹是肩并肩安排的；请参见US D698037 和 US D794823）所取代了。（但是我猜想，那是Novex公司摆弄出来的，所以Novex公司没有出局；而Bio-Rad 公司则好像出局了？）
非传统式电泳池之所以受到欢迎，主要是因为它把两个灌胶夹的两个U形上缺口（加样口）都改为朝向操作者了，这样便于加样操作；而且还把驱使机构改放到灌胶夹的后面去了，那样它就不会再阻挡操作者的视线了。这些都是其优点。但是，非传统式电泳池必须采用两套驱使机构和两套正/负电极。而且因为它那里采用了Novex 公司的那种驱使机构，就使得它只能够采用Novex 式的那种7毫米厚的预灌胶来跑电泳了；而对于那些广泛存在的，可以反复使用的4毫米厚的玻璃灌胶夹则不能够兼容。这些缺点就使得非传统式电泳池十来年都还没能够推广到其它国家去。看来是和人家那里“水土不服”吧。
针对上述非传统式电泳池的缺点，本人设计了一种“反传统式垂直薄片凝胶电泳池”。它的美国专利号：US 10145817; 它的发明名称：“Anti-traditional vertical slice gel electrophoresis cell and a telescopic urging mechanism”。它的中国专利号***：CN 106404872。它的中文发明名称：“一种垂直片式凝胶电泳池以及一种可伸缩的驱使机构”。本反传统式电泳池的优点包括：它的两个灌胶夹是背靠背安排的。因此当你加样时，你所面对的那个灌胶夹的U形上缺口总是正好朝向你的；它的驱使机构处在两个灌胶夹之间，那就不会再遮挡操作者的视线了。与上述非传统式的电泳池相比，它少用了一条白金丝电极，还少用了一套驱使机构。这样既降低了成本也简化了操作；而使得只需要一步操作，它就能够让两个灌胶夹安装就位了。本电泳池的另一个大优点是它能够采用各种厚度不同的灌胶夹。此优点将会使得本电泳池比较容易推广到世界各国去。此外，只要把设计的尺寸放大一些，那么制造出来的就是中型电泳池了。
行家说：看一个专利，先读它的摘要。
摘要：用透明材料做成一个其内部长有一对U形门框的矩形容器，并且沿着每个U形门框都各自镶有一条U形橡胶密封条镶边；于是该透明容器的内部就被这样一对U形门框划分为三个隔间了；居中的那个隔间是用来安放一个驱使机构以及两个垂直片式灌胶夹的，当那两个灌胶夹受到推挤而分别抵靠在那两条U形橡胶密封条上时，所说的那三个隔间就变成三个水密隔间了；其中一左一右的那两个水密隔间就成为本电泳池的两个上缓冲液槽了。此外，一种可以伸缩的驱使机构的发明和采用，就使得本电泳池能够和市场上所有的那些小型垂直片式灌胶夹，或预灌胶们全都能够兼容了，无论它们的厚度如何。
美国的Lab里已经完成小型垂直片式凝胶电泳池的一步升级换代了。美国的大经销商Fisher等一直想在中国这个最大的市场里推行同样的事情。中国的生物科技公司们正在与之博弈。我所做的事情是发明了第三种构形的垂直片式凝胶电泳池，并且为之申请了两个大国的专利保护，以便为有志趣弯道超车的公司提供十几、二十年的独家经营权。至于签约的公司有没有齐全的加工手段并不重要，重要的是要有独到的眼光和坚定的行动。因为像电泳池这类由几个塑料部件构成的小仪器，从其模具制造到其塑料部件的注塑成型，是完全可以外包给乙方去加工的。然后甲方只要及时地把模具和注塑件收回来锁在自己的库房里；每週安装多少付电极线等，就可以出品多少台“反传统式垂直薄片凝胶电泳池”了。每台像塑料饭盒大小的装置能够卖到一台基本型膝上电脑的价位；还要怎样？
双灌胶夹的电泳池只可能有四种不同的构型。它们分别是：“面对面”，“肩并肩”，“背靠背”和“以前一后”这样4种不同的排列方式。如果我们这第三种构型不比那前两种好的话，就不会有人去动脑筋把它设计出来。而那第四种构型的电泳池是不可取的。因为一旦你把两个灌胶夹一前一后地排列起来了，那么那两个灌胶夹在电流上就变成串联的关系了。
发明人: 周德明 邮箱: deming98@hotmail.com 2021/05/15改稿
*如今电泳在工业界的应用主要是“电泳涂漆”。
**那可不仅仅是换换材料的一件小事。实践者们发现：他们采用的透明度较好的那种塑料做成的灌胶夹会释放出（吸附的？）氧气来干扰丙烯酰胺的聚合反应。因而使得所形成的凝胶片既网孔大小不一，又不能够很好地附着在塑料外壳上。Novel公司的解决办法是：采用真空溅射法在灌胶夹的内表面溅射上一层透明、惰性的氧化硅隔离层（请参见US 5685967）。而Bio-Rad公司的解决办法则是：在凝胶形成液中掺入某种氧气吸收剂来消耗掉所说的氧气（请参见US 6846881）。由此可见材料方面也是大有学问的。有了上述知识以后，咱们就不难理解：为什么1971年就申请了美国专利的那种“完全用有机玻璃粘合而成的小型垂直片式凝胶电泳装置”始终没有能够流行起来的原因了（请参阅US 3719580）。
***本反传统式电泳池的中国专利申请人童阶平先生已经不幸病故。有兴趣签约的公司既可与本发明人联系，也可以与本发明的中国专利申请的代理机构《苏州创元专利商标事务所》联系。地址: 苏州市215002; 干将西路93号; 国涛商务大厦523室; 法人暨总经理: 范晴; 手机: 138 0620 1126; 邮箱: fan@szpat.com .
