微生物菌种的保存与分离方法
微生物菌种的保存方法：
1、低温存法：①简单保存法，将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1～2个月，若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3～4个月；②液氮超低温保存法，将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至 -35℃时，即可置于-150～-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。
2、脱水存法：①沙土保存法，能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合，经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2～3次，烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子，用无菌蒸馏水2～2.5ml制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干，外观呈松散状态,于4℃冰箱保存，保存期可达5～7年。② 冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂（一般用脱脂牛奶或血清）相混合，放在安瓿管内于-20～-30℃的乙醇浴中速冻。然后，在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，熔封安瓿管，于低温下保存。保存期可达5～10年之久。③ 石蜡油封存法，在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油，高出斜面1cm，于4℃冰箱或低温干燥处保存，此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。
微生物菌种的分离方法：
(1)施加选择性压力分离法：主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、 pH 、渗透压、 氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他 种类微生物的生存, 以达到使目的菌种占优势. 而得以快速分离纯化的目的。 如可以控制培 养时的氧, 可将好氧微生物和厌氧微生物分开; 通过控制温度, 可将嗜热微生物和非嗜热微 生物分开;控制 pH ,可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗 生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时,可加入抗真菌抗生素;分离真菌时, 可加入抗细菌药物。
(2)随机分离方法：有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用,因此常采用随机分离方法分离。 A 、抗生素产生菌的分离。抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。 实验必须用工具菌:采用抗生素的敏感菌, 传统上常用 金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。B、抗肿瘤药物产生菌的分离。抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法:生化诱导法、 SOS 生色检测法、 DNA 修复能力突变株。 原理是利用 DNA 的损伤,微生物发生突变。
(3)目的微生物分离：A 、根据形态筛选突变株；B 、根据平板菌落生化反应筛选变株；
透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。
1、低温存法：①简单保存法，将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1～2个月，若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3～4个月；②液氮超低温保存法，将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至 -35℃时，即可置于-150～-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。
2、脱水存法：①沙土保存法，能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合，经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2～3次，烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子，用无菌蒸馏水2～2.5ml制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干，外观呈松散状态,于4℃冰箱保存，保存期可达5～7年。② 冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂（一般用脱脂牛奶或血清）相混合，放在安瓿管内于-20～-30℃的乙醇浴中速冻。然后，在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，熔封安瓿管，于低温下保存。保存期可达5～10年之久。③ 石蜡油封存法，在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油，高出斜面1cm，于4℃冰箱或低温干燥处保存，此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。
微生物菌种的分离方法：
(1)施加选择性压力分离法：主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、 pH 、渗透压、 氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他 种类微生物的生存, 以达到使目的菌种占优势. 而得以快速分离纯化的目的。 如可以控制培 养时的氧, 可将好氧微生物和厌氧微生物分开; 通过控制温度, 可将嗜热微生物和非嗜热微 生物分开;控制 pH ,可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗 生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时,可加入抗真菌抗生素;分离真菌时, 可加入抗细菌药物。
(2)随机分离方法：有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用,因此常采用随机分离方法分离。 A 、抗生素产生菌的分离。抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。 实验必须用工具菌:采用抗生素的敏感菌, 传统上常用 金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。B、抗肿瘤药物产生菌的分离。抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法:生化诱导法、 SOS 生色检测法、 DNA 修复能力突变株。 原理是利用 DNA 的损伤,微生物发生突变。
(3)目的微生物分离：A 、根据形态筛选突变株；B 、根据平板菌落生化反应筛选变株；
透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。
