再登Nature Genetics-ecDNA与致ai基因扩增及多种ai症不良预后相关
文章导读
研究发现，许多扩增的原ai基因，并不只是位于染色体，而且还能变成游离的染色体外DNA（ecDNA），并出现大量拷贝，而且相当高比例的ecDNA是以环状DNA分子的形式存在，即eccDNA（染色体外环状DNA）。由于ecDNA不存在着丝粒，所以在细胞有丝分裂时，无法被均等地分配到两个母细胞中，这就导致ecDNA的拷贝数会随着细胞代数的增加而呈现巨大的异质性，从而驱动肿 瘤演化过程，但是关于ecDNA发生频率和临床影响尚不清楚。
2020年8月17日发表在Nature genetic（IF=27.603）上的一篇题为《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA与致ai基因扩增及多种ai症的不良预后间的相关性。通过对3212名ai症患者的全基因组测序数据的分析，研究人员发现ecDNA扩增通常发生在大多数ai症类型中；与线性DNA相比，ecDNA扩增而引起的ai基因转录水平更高，同时染色质的可及性得到增强，能够更频繁地与转录本融合；携带ecDNA的ai症患者的生存期也明显短于非ecDNAai基因扩增引起的ai症患者。此次研究结果表明，基于ecDNA的ai基因扩增在ai症中普遍存在，并导致许多ai症类型的患者预后不良。
实验方法：Circle-Seq，全基因组测序，ATAC-seq
文章链接：《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》
研究内容
1.eccDNA扩增广 泛存在于各类ai症类型中
ai基因扩增是ai细胞中常见的功能获得性改变，使肿 瘤细胞能够规避体内平衡期间的制约和平衡，从而驱动肿 瘤生长。基于ecDNA的扩增一直被认为是细胞增加特定基因拷贝数(CN)的一种方法，但它们的发生频率尚不清楚。全基因组测序(WGS)数据的计算分析和新的环状DNA文库富集方法表明，在中枢 神经系统的肿 瘤中ecDNA的频率相对较高。
研究人员应用AmpliconArchitect基于 WGS肿 瘤组织的数据，与正常组织和血液ai症基因组图谱(TCGA) (n = 3731)比较，通过全基因组的泛ai分析(PCAWG)(n = 1291)量化并区分结构区域大于10kb，超过4倍（CN > 4，样本中位数以上倍数）的扩增子，这些扩增子分为(1)‘环状’(图1a)，表示存在于染色体外的扩增子；(2)‘BFB’，带有由‘断裂-融合-桥’(BFB)机制创建的标记；(3)‘重排列’，指含有来自不同染色体或染色体上相距很远的DNA片段的非环状扩增子(>1 Mb)；(4)‘线性’，表示线性扩增。扩增子状态是肿 瘤标本分类的依据。缺乏扩增的样本标记为“未检测到局部体细胞CN扩增”（图1a）。
测序结果表明，AmpliconArchitect在区分环状DNA扩增子和线性DNA扩增子方面，WGS和环状DNA测序（Circle-Seq）方法具有非常高的一致性（图1b），表明分类的可靠性。基于AmpliconArchitect分类WGS中的 3212个肿 瘤样本数据集和1810个非肿 瘤数据集，研究人员从中发现460例(14.3%)肿 瘤样本进行1或多个环状扩增子，证明在ai症中ecDNA扩增是一种常见的事件。相比之下，环状扩增在匹配的全血或正常组织样本中几乎检测不到(图1c)。环状扩增子频率的分布与早期ai症模型的结果一致，表明ecDNA扩增是多种ai症亚型的明确特征，而非正常细胞。
579个环状扩增子的染色体分布与非环状扩增子的染色体区域相比是非随机的(图2a)。在24个常复发的扩增ai基因中，有38%常出现在环状扩增子上，其中PAX8占11%，CDK4占62%(图2b)。在至少5个样本扩增的1,804个ai基因列表中，21.8%的ai基因具有多个环状结构扩增。对于高度扩增的ai基因(即CN > 8)，这一比例进一步增加到53.5%。中枢 神经系统中ai基因的环状扩增比非环状扩增更高。通过进一步观察，ecDNA结构和ai基因扩增之间的关联并未延伸到断点。对于24个频繁扩增的ai基因，在单位间隔内观察特定数目断点的频率呈指数衰减，这与在ai基因周围的大多数随机发生保持一致(图2c)。这些结果表明，ecDNA是通过随机过程形成的，对促生长ai基因高拷贝的选择导致ai基因在肿 瘤发育过程中快速扩增，而由于其遗传不均一，保留了瘤内的遗传异质性。
环状ecDNA扩增的转录结果发现，在所有扩增子类别中观察到DNA CN和ai基因表达水平高度明显相关(图3a)。然而，DNA CN归一化后，环状扩增子上的ai基因表达明显高于非环状扩增子。转录活性中不依赖于CN的增加现象可能部分是因为增强子劫持机制和ecDNA上染色质可及性提高。为了比较环状扩增和非环状区域之间控制基因表达的表观遗传机制，采用36个样本(ATAC-seq)图谱分析了转座酶可达染色质的重叠分析。经DNA CN水平校正后，环状和BFB扩增子的染色质明显比重排列和线性扩增子更容易接近(图3b)，因此，增加的染色质可及性在ecDNAai基因的失调中扮演了一个重要的角色。与非环状扩增相比，环状扩增的转录子融合频率增加了5倍(图3c)。我们观察到围绕环状扩增子结构的DNA CN，RNA表达和染色质可及性的聚集(图3d)。
通过临床数据分析发现，与非环状或无扩增的肿 瘤相比，含有ecDNA扩增的肿 瘤患者的5年生存率明显更差(Fig. 4a)，并且环状扩增子在恶性肿 瘤如胶质母细胞瘤中更为普遍。文章通过拟合了Cox比例风险模型说明与疾病亚型相关的生存率，该模型在控制了疾病亚型后测试生存率。模型显示，携带圆形扩增子的肿 瘤患者的危险比明显更高(图4b)。这些发现暗示染色体外DNA扩增与恶性肿 瘤的侵袭性行为有关，可能是通过为肿 瘤提供额外的途径来绕过治 疗和其他进化瓶颈。
总结
eccDNA测序（别名：Circle-Seq﹑环状DNA测序）是eccDNA检测利器，可以高通量地对各种物种样本当中检测样品中的所有eccDNA，具有检出率高﹑准确性好等优点。云序生物eccDNA测序采用多种方法高效地富集和扩增eccDNA，简述如下：首先，利用离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶进一步对富集的eccDNA进行消化除去残余线性DNA。富集纯化后，通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝，再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。严谨的实验流程，极大地提高了eccDNA的检出率和检测灵敏度。通过严谨的eccDNA生信流程，实现了对eccDNA准确的识别和详细的基因注释，快速找到ai症、肿 瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA。
研究发现，许多扩增的原ai基因，并不只是位于染色体，而且还能变成游离的染色体外DNA（ecDNA），并出现大量拷贝，而且相当高比例的ecDNA是以环状DNA分子的形式存在，即eccDNA（染色体外环状DNA）。由于ecDNA不存在着丝粒，所以在细胞有丝分裂时，无法被均等地分配到两个母细胞中，这就导致ecDNA的拷贝数会随着细胞代数的增加而呈现巨大的异质性，从而驱动肿 瘤演化过程，但是关于ecDNA发生频率和临床影响尚不清楚。
2020年8月17日发表在Nature genetic（IF=27.603）上的一篇题为《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA与致ai基因扩增及多种ai症的不良预后间的相关性。通过对3212名ai症患者的全基因组测序数据的分析，研究人员发现ecDNA扩增通常发生在大多数ai症类型中；与线性DNA相比，ecDNA扩增而引起的ai基因转录水平更高，同时染色质的可及性得到增强，能够更频繁地与转录本融合；携带ecDNA的ai症患者的生存期也明显短于非ecDNAai基因扩增引起的ai症患者。此次研究结果表明，基于ecDNA的ai基因扩增在ai症中普遍存在，并导致许多ai症类型的患者预后不良。
发表期刊：Nature Genetics
影响因子：27.603实验方法：Circle-Seq，全基因组测序，ATAC-seq
文章链接：《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》
研究内容
1.eccDNA扩增广 泛存在于各类ai症类型中
ai基因扩增是ai细胞中常见的功能获得性改变，使肿 瘤细胞能够规避体内平衡期间的制约和平衡，从而驱动肿 瘤生长。基于ecDNA的扩增一直被认为是细胞增加特定基因拷贝数(CN)的一种方法，但它们的发生频率尚不清楚。全基因组测序(WGS)数据的计算分析和新的环状DNA文库富集方法表明，在中枢 神经系统的肿 瘤中ecDNA的频率相对较高。
研究人员应用AmpliconArchitect基于 WGS肿 瘤组织的数据，与正常组织和血液ai症基因组图谱(TCGA) (n = 3731)比较，通过全基因组的泛ai分析(PCAWG)(n = 1291)量化并区分结构区域大于10kb，超过4倍（CN > 4，样本中位数以上倍数）的扩增子，这些扩增子分为(1)‘环状’(图1a)，表示存在于染色体外的扩增子；(2)‘BFB’，带有由‘断裂-融合-桥’(BFB)机制创建的标记；(3)‘重排列’，指含有来自不同染色体或染色体上相距很远的DNA片段的非环状扩增子(>1 Mb)；(4)‘线性’，表示线性扩增。扩增子状态是肿 瘤标本分类的依据。缺乏扩增的样本标记为“未检测到局部体细胞CN扩增”（图1a）。
测序结果表明，AmpliconArchitect在区分环状DNA扩增子和线性DNA扩增子方面，WGS和环状DNA测序（Circle-Seq）方法具有非常高的一致性（图1b），表明分类的可靠性。基于AmpliconArchitect分类WGS中的 3212个肿 瘤样本数据集和1810个非肿 瘤数据集，研究人员从中发现460例(14.3%)肿 瘤样本进行1或多个环状扩增子，证明在ai症中ecDNA扩增是一种常见的事件。相比之下，环状扩增在匹配的全血或正常组织样本中几乎检测不到(图1c)。环状扩增子频率的分布与早期ai症模型的结果一致，表明ecDNA扩增是多种ai症亚型的明确特征，而非正常细胞。
图 1 肿 瘤与非肿 瘤组织的环型扩增子发生频率
2.复发性ai基因扩增往往发生在ecDNA上579个环状扩增子的染色体分布与非环状扩增子的染色体区域相比是非随机的(图2a)。在24个常复发的扩增ai基因中，有38%常出现在环状扩增子上，其中PAX8占11%，CDK4占62%(图2b)。在至少5个样本扩增的1,804个ai基因列表中，21.8%的ai基因具有多个环状结构扩增。对于高度扩增的ai基因(即CN > 8)，这一比例进一步增加到53.5%。中枢 神经系统中ai基因的环状扩增比非环状扩增更高。通过进一步观察，ecDNA结构和ai基因扩增之间的关联并未延伸到断点。对于24个频繁扩增的ai基因，在单位间隔内观察特定数目断点的频率呈指数衰减，这与在ai基因周围的大多数随机发生保持一致(图2c)。这些结果表明，ecDNA是通过随机过程形成的，对促生长ai基因高拷贝的选择导致ai基因在肿 瘤发育过程中快速扩增，而由于其遗传不均一，保留了瘤内的遗传异质性。
图 2 环型扩增子的ai基因含量和结构成分
3.与线性DNA相比，ecDNA扩增导致的ai基因转录水平更高环状ecDNA扩增的转录结果发现，在所有扩增子类别中观察到DNA CN和ai基因表达水平高度明显相关(图3a)。然而，DNA CN归一化后，环状扩增子上的ai基因表达明显高于非环状扩增子。转录活性中不依赖于CN的增加现象可能部分是因为增强子劫持机制和ecDNA上染色质可及性提高。为了比较环状扩增和非环状区域之间控制基因表达的表观遗传机制，采用36个样本(ATAC-seq)图谱分析了转座酶可达染色质的重叠分析。经DNA CN水平校正后，环状和BFB扩增子的染色质明显比重排列和线性扩增子更容易接近(图3b)，因此，增加的染色质可及性在ecDNAai基因的失调中扮演了一个重要的角色。与非环状扩增相比，环状扩增的转录子融合频率增加了5倍(图3c)。我们观察到围绕环状扩增子结构的DNA CN，RNA表达和染色质可及性的聚集(图3d)。
图 3 不同类型扩增子的基因表达和染色质可及性
4.携带ecDNA的ai症患者生存期更短通过临床数据分析发现，与非环状或无扩增的肿 瘤相比，含有ecDNA扩增的肿 瘤患者的5年生存率明显更差(Fig. 4a)，并且环状扩增子在恶性肿 瘤如胶质母细胞瘤中更为普遍。文章通过拟合了Cox比例风险模型说明与疾病亚型相关的生存率，该模型在控制了疾病亚型后测试生存率。模型显示，携带圆形扩增子的肿 瘤患者的危险比明显更高(图4b)。这些发现暗示染色体外DNA扩增与恶性肿 瘤的侵袭性行为有关，可能是通过为肿 瘤提供额外的途径来绕过治 疗和其他进化瓶颈。
图 4 环型扩增子与不良预后相关
总结
本文作者通过提供的数据分析，发现环状ecDNA在ai症中发挥关键作用，环状ecDNA为实现和维持高拷贝ai基因扩增和多样性，同时驱动染色质可达性增强和ai基因转录升高。这种扩增机制在很大一部分人类ai症中起作用，并对患者预后产生负面影响，与ai症谱系无关。结果展示了ecDNA在ai症中的应用。考虑到ai症的异质性，可以肯定不同类型的ai症之间存在ecDNA结构和行为的多样性。进一步的研究将有助于更好地理解产生包括ecDNA在内的基因组重排的机制，如深入研究跨ai症的复杂结构变异的模式。本文在ai症基因组学和广 泛的患者群体实用性之间建立联系，发现人类ai症中ecDNA进行诊断或治 疗的潜力。
eccDNA测序（别名：Circle-Seq﹑环状DNA测序）是eccDNA检测利器，可以高通量地对各种物种样本当中检测样品中的所有eccDNA，具有检出率高﹑准确性好等优点。云序生物eccDNA测序采用多种方法高效地富集和扩增eccDNA，简述如下：首先，利用离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶进一步对富集的eccDNA进行消化除去残余线性DNA。富集纯化后，通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝，再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。严谨的实验流程，极大地提高了eccDNA的检出率和检测灵敏度。通过严谨的eccDNA生信流程，实现了对eccDNA准确的识别和详细的基因注释，快速找到ai症、肿 瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA。
云序生物eccDNA测序实验示意图
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