新型冠状病毒病原学检测假阴性的产生原因及高效检测方法分析

自2020年开始，新型冠状病毒肺炎的疫情就一直牵动着亿万人的心。截至2月11日8:29，全国已确诊病例累计42708例，疑似21675例，疫情防控形势依然严峻。

 

新型冠状病毒传播方式多样，除了经呼吸道飞沫和接触传播的主要途径外，目前已有报道病毒还可以经由气溶胶、消化道、母婴等不同方式传播，传播渠道多，传染力强。因此，控制nCov病毒传播比SARS等以往冠状病毒传播更加困难，也是目前感染率居高不下的重要原因之一，早发现，早隔离，早确诊，早治疗是本次疫情防控的重中之重。

 

根据国家发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（第五版）》，“疑似”和“确诊”的含义是：

 

 

由此可见，除了及早发现临床表现异常之外，及早从病原学确诊更是疫情防控的重要一环。快速确诊不但可以尽早对病人施以对症的治疗方法和药物、增加病人存活率，更可以减少医疗物资的使用量，提高医疗效率，更有力的控制疫情。

 

对于病原学检测，虽然有研究表明CRISPR和免疫方法也可用于病毒检测，但荧光RT-PCR和基因测序目前仍是唯二被认可的方法。两者相比，前者无疑有更大的优势，通常在1小时内即可检测接近几十甚至几百个核酸样本。所以，当前诸多医院和医检所均采用RT-qPCR的方法，使用官方公布的引物和探针，检测nCov的N1，N2，N3三个靶标基因检测和人类RNase P，通过阴性对照、阳性对照和目的基因的Ct值判断标本中是否含有nCov病毒（Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus, www.cdc.gov）。

 

另一方面，确诊除了需要速度，更需要精度，要在最大程度避免假阴性的产生。假阴性不但会造成对个体的错误判断，延误病情，更有可能造成传染源的遗漏，造成更大规模的传染。假阴性的产生原因主要有以下几点：

1. 样本采集不当，并未采集到合理位置的标本，病毒含量不能反映真实状况。

2. 样本保存和处理不当，造成处理过程中病毒RNA降解。

3. 提取效率低，病毒并未完全提取，或提取过程中病毒降解。

4. 检测分辨率低，检测下限过高，导致无法检出病毒。

5. 实验员操作不当。

由此可见，无论是RT-qPCR检测步骤，还是检测之前的病毒核酸提取的步骤，都要最大程度的避免产生假阴性。

 

标准的样本类型，规范的样本采集、处理和运输，是避免假阴性的第一步。虽然已有报道病毒会通过粪口等其他方式传播，但目前世界卫生组织（WHO）的最新资料表明，呼吸材料（鼻咽和口拭子、痰液、肺泡灌洗液等）和血清样本是检测nCov的标准。WHO给出的临时指导中，样本类型、采集和储运的方式如下（Laboratory testing for 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases）：

 

 

在核酸提取层面，避免假阴性最重要的就是要提高核酸的得率。提高得率的难点有三：1. 上述样本不属于培养细胞等简单医疗样本，样本类型多，成分复杂，杂质含量高，对样本裂解效率有很大影响。2. 病毒含量较低，相应的对提取效率的要求就很高，要求提取得率尽量高，能够满足后续检测的要求。3. 样本中RNA酶会在提取过程中导致病毒RNA降解。因此，在提取时需选用得率高、纯度高的试剂盒。此外，在提取过程中，对操作人员的要求也比较高，在提取之前应进行整体培训，避免操作错误或引入RNA酶等杂质。

 

获取核酸之后，RT-qPCR检测nCov病毒核酸也有需要注意的几点：1. 尽量提高检测分辨率，能够检出低丰度的核酸模板，避免假阴性。2. 尽量提高检测的准确率，避免非特异性信号造成假阳性。3. 尽量提高检测稳定性，对于同一核酸样本的检测结果平行性好。此外，定量实验的速度也是整体病毒检测速度中的决定因素，应选择操作简便、速度快的试剂盒进行检测。

 

天根生化科技（北京）有限公司作为中国核酸提取和检测试剂上游供应的领军企业，多次为国家病毒性流行病（如手足口病毒、甲型H1N1流感病毒、非洲猪瘟病毒疫情等）的诊断及预防提供帮助。目前天根生化正在持续为全国三十多家检测单位提供病毒核酸提取、荧光定量检测试剂以及相关仪器设备。

 

 

 

DP315-R拥有独特的裂解液RL，能够应对冠状病毒检测的各类样本：血液、血清/血浆、组织、拭子、病毒等，裂解效率高，抗逆性强，还含有保护成分，避免RNA降解。试剂盒中特别配备了Carrier RNA用于充分收集微量RNA，提取得率高，最大限度的捕获病毒核酸。此外，离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附RNA，可最大限度去除杂质蛋白等，提高收集的核酸纯度。

 

• 高效率：快速纯化得到高质量病毒RNA，重复性高

• 高得率：Carrier RNA收集微量核酸，提取灵敏度高，得率高

• 高纯度：完全抵抗和去除污染物和抑制剂，方便下游应用

• 高安全性：无有机试剂抽提或乙醇沉淀

 

 

 

 

FP314特别为检测样本中的微量基因和微量RNA病毒设计。试剂盒集成了反转录和荧光定量模块，一步完成从反转录到定量的全部操作，操作简单、快速。试剂盒中使用的King反转录酶和新型抗体修饰的Taq聚合酶均为新型工程酶，模板识别灵敏度高，抗逆性强，特别适合复杂环境中低丰度RNA模板的检测。本试剂盒是基于探针法设计，配合官方公布的引物和探针，对nCov病毒核酸的检测具有极高的准确率。

 

• 高效：性能优良的逆转录酶和DNA聚合酶保证了极高的反应效率

• 灵敏：低至1 ng 的模板也能被准确识别，特别适合低丰度模板

• 抗逆：通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板

• 普适：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高