影响RT-PCR的因素和反转录引物的选择
反转反转，改变一点点，实验大反转！
科研党们整天都在为提取RNA而烦恼，费尽九牛二虎之力，终于！RNA质量完美！可是。。。qPCR/PCR结果依然不好，咋整?！
在做qPCR/PCR实验之前，必不可少的一步就是反转录。别小看它哦，它在整个实验流程中发挥着重要作用！
反转录（Reverse transcription ）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术（图1）。
图1
影响RT-PCR的因素主要可以概括为以下几点：
1） RNA的质量
反转录必须保证实验使用的RNA质量（如图2所示）：琼脂糖电泳胶图包括28S和18S两条清晰明亮的条带（真核样品），且28S/18S≈2:1，A260/280≈2.0，泳道无弥散区、无基因组、蛋白污染等。
图2 思科捷货号：AC0307，样本：玉米种子
2） 反转录酶的热稳定性
常规反转录酶发挥作用的最佳温度在42℃左右，但常规温度很难打开复杂模板中的二级结构，直接阻碍cDNA的继续合成；选择热稳定性高的反转录酶，可以在高温打开复杂模板中二级结构的同时发挥作用，极大的提高了复杂模板的反转录效率（图3）。
图3
3） 反转录引物的选择
反转录实验可供选择的引物主要包括3种，其各自特征及优缺点如下表所示。可见，根据后续实验的不同要求，需要选择合适恰当的引物进行反转录实验，这同样也是反转录PCR中重要的一环。
表1
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引物类型 |
特征 |
优势 |
劣势 |
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Oligo dT或
锚定Oligo dT |
Oligo dT引物适用于识别mRNA末端的Poly A尾；
锚定Oligo dT在3’端包括G、C或A残基。 |
可从含Poly A尾的mRNA合成全长cDNA;
锚定碱基保证了引物结合在Poly A 5’端。 |
只能扩增含有Poly A尾的mRNA，对RNA样品的质量要求较高。 |
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随机引物 |
含6-9个碱基，可随机识别并在退火时结合在模板RNA上。 |
可同所有类型的RNA结合；适合于含有二级结构RNA，或微量样本；得率高。 |
产物来自所有RNA模板，可能会对目的片段造成稀释；cDNA小片段较多。 |
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序列特异性
引物 |
识别特定模板序列 |
产物特异性及反应灵敏度高。 |
只能合成特异性的某条序列。 |
图4
当所有试剂准备就绪，即可进行反转录体系的配制。常规的RT-PCR体系的配制需要加入引物、模板、反转录酶、RNase Inhibitor、RT Buffer、dNTP、RNase-free H2O等等试剂，操作步骤繁琐复杂。
那么，重点来啦！！
思科捷AG0304试剂盒为一管式反转录预混 Mix，其中2×SPARKscript Ⅱ RT Plus Master Mix 中含有反转录第一链合成所需的所有试剂（SPARKscript Ⅱ Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random Primer、Oligo（dT）Primer、dNTP Mixture、Buffer），其中特别优化了Oligo dT和N6随机引物的配比，使cDNA合成可从RNA转录的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证后续实验结果的真实性和可重复性；此外，试剂盒中还包含具有 DNA 分解活性的特殊 gDNA Eraser Mix，5 分钟消除 gDNA 残留，不需要 DNase 消化或更多繁琐步骤。
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（同时搭配思科捷RNA提取试剂Trizol （AC0101）和qPCR试剂（AH0104）效果更棒呢！）
思科捷小彩蛋：
如何证明RNA反转录是否成功？
因为cDNA 是长短不一的 DNA 片断混合物，所以电泳的结果大多是模糊一片的，如果 RNA 丰度较低，电泳也可能是无产物，但是这种情况并不代表 PCR 会无结果。检测 cDNA 可以用定量的方法首先看一下内参有没有扩增出来，内参有结果，cDNA 的质量基本上可以保证。但能扩增出内参，不一定就说明 cDNA 没有问题。因为内参在 cDNA 中丰度高，很容易扩出。如果 cDNA 存在部分降解，从机率的角度讲，就会大大影响低丰度的目的基因的 PCR 结果，而内参因为依然是高丰度，扩增很可能不受影响。有些 GC 含量高， 二级结构复杂的 RNA 模板，低温很难将二级结构打开，使用普通的逆转录酶很难奏效，此时可以选择思科捷AG0304，该酶可耐受高至 55℃高温，能够高效反转录多种 RNA 模板，最大限度将 RNA 逆转录成 cDNA 第一链。
图5 采用思科捷AG0304和竞品品牌V分别对RNA1、RNA2进行反转录，思科捷AH0104进行qPCR，获得扩增曲线如图所示，CT（AG0304反转获得的cDNA）＜CT（某品牌V反转获得的cDNA） ，可见思科捷AG0304的反转录效率高于某品牌V。
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