酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）的原理及应用

检测原理：
       酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是用于体内研究蛋白相互作用的一种非常便利的工具，常用的如GAL4为基础的系统，使用酵母转录因子GAL4来检测转录激活后的蛋白相互作用。某些转录因子（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独立的结构域组成，N端有一个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）结合，而AD能激活UAS下游基因进行转录。单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种方式结合在一起形成完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱、瞬间的作用都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应用：
对新的与已经蛋白相互作用的鉴定
对预测蛋白相互作用的确认
对蛋白相互作用区域的鉴定

酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
一、诱饵（the bait）
为了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推荐使用质粒pGBKT7；
要调查三元蛋白复合物，推荐使用含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二个感兴趣蛋白，在bait和prey蛋白之间发挥桥梁作用。

二、检测蛋白作用的四个报告基因
Matchmarker gold系统是采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统。其采用新型稳定的酵母双杂交抗生素- 金担子素Aureobasidin A （AbA）（货号：M0129），可有效杀死非抗性克隆，从而大大降低背景克隆生长。同时有效缩减假阳性，由于人和prey蛋白单独将结合引起假阳性都需要识别3个不同序列，激活4个报告基因的表达。
4个报告基因分别是：1个AbA抗生素筛选报告基因，2个营养筛选报告基因，1个蓝白斑筛选报告基因。

1）  AUR1-C
AUR1基因的主要突变版，能够表达肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。当蛋白发生作用促使GAL4转录激活，AUR1-C基因进行表达。酿酒酵母中此基因的表达孵育其对高毒抗生素金担子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景极其低，这一筛选报告子由于单一的营养缺陷报告子。
2）  HIS3
Y2HGold菌株不能合成组氨酸，从而无法在缺少这一必须氨基酸的培养基上生长。当诱饵和诱捕蛋白相互作用，Gal4反应性的His3表达促使细胞合成组氨酸并能在His缺陷培养基上生长。
3）  ADE2
Y2HGold菌株无法在不含腺嘌呤的基本培养基上生长，但当两个蛋白相互作用，Ade2表达被活化，细胞能在Ade缺陷的基础培养基上生长。
4）  MEL1
MEL1编码α-半乳糖苷酶，存在许多酵母菌内的天然表达蛋白。当双杂交发生，MEL1表达和分泌，在底物X-α-Gal（货号：M5831-100mg）存在的情况下，酵母菌落变为蓝色。

三、三个不同的结合位点（three different binding sites）
Y2HGold菌株三个启动子控制4个报告基因是不相关的，除UAS区域的短蛋白结合位点特异性结合Gal4 DNA-BD。因此，诱捕蛋白（文库蛋白或靶蛋白）与UAS内部或边缘的不相关序列作用（假阳性）就会自动被筛查出来。
 Matchmarker酵母菌株的报告基因构造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C报告基因分别由三个完全异源的Gal4反应启动元件-G1，G2，M1操控。而启动子内的蛋白结合位点是不同的，虽然每一个结合位点与Gal4识别的17-mer共有序列相关联。
酵母双杂交系统操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
完整的Matchmarker筛选过程包含以下步骤：
第一步：执行对照实验；
第二步：诱饵载体的构建及自我激活和毒性检测；
第三步：筛选Mate&Plate文库
第四步：确认和阐释结果
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